一種可用于全血檢測的快捷去除紅細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥衛(wèi)生領域，提供了一種簡單且快速的有效分離血紅細胞的方法。該方法結合免疫凝集與磁性分離技術，通過羊抗人血紅細胞抗體與血紅細胞形成抗原-抗體復合物，再與包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球發(fā)生免疫吸附從而產生更為強烈的凝集反應，進而磁性分離達到去除紅細胞的目的。該發(fā)明通過簡單快速的方法去除樣本中的紅細胞，可應用于全自動和半自動化學發(fā)光儀，以便于實現(xiàn)普通試劑盒的全血檢測。
【專利說明】-種可用于全血檢測的快捷去除紅細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥衛(wèi)生領域，提供了一種簡單且快速有效分離血紅細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 目前臨床上血清分離的方法為采血后，采血管靜置30分鐘,通過離心將紅細胞、 白細胞、血小板與血清分開。由于離心過程中產生一定的離心力，這種離心力會導致血紅細 胞堆積從而導致細胞的破裂造成溶血。離心是一個復雜的過程，尤其是在樣本量大的時候， 即使是熟練的操作人員很難保證操作每份樣本的均一性。相關文獻報道，由離心分離操作 不當導致的溶血，占溶血現(xiàn)象的41. 2%。
[0003] 紅細胞會干擾常規(guī)試劑盒中免疫磁珠捕獲抗原的性能，這也是諸多常規(guī)的化學發(fā) 光試劑無法檢測全血樣本的原因，此外紅細胞的破裂會造成大量的血紅蛋白、高濃度離子 或酶釋放，會引起測量誤差，從而極大降低了標本檢測的準確性。在檢測過程中，溶血現(xiàn)象 會增加假性的比例。
[0004] 此外，常規(guī)的血紅細胞分離手段耗時較長，且操作復雜，一旦樣本量增大將會帶來 極大的人工成本。此外，某些項目的分子標志物半衰期非常短，僅為十幾分鐘，此時快速的 檢測，可以更準確、真實的反應待測分子的含量；在心肌梗塞患者中，更會體現(xiàn)精短的測量 時間帶來的優(yōu)勢，有利于為患者爭取寶貴的時間以便在第一時間內進行治療。
[0005] 例如在PCT的檢測過程中發(fā)現(xiàn)它在細菌感染時升高，并且其升高程度與感染 嚴重程度、病情預后密切相關。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在細菌感染初期，已經有 PCT低水平的升高，文獻報道，健康人體內PCT的含量不超過0.05ng/ml ;PCT含量介于 0. 05-0. 25ng/ml之間時預示著有輕微感染不推薦使用抗生素治療，需做進一步觀察；當 PCT含量大于0. 25ng/ml且小于0. 5ng/ml時有局部感染，推薦使用抗生素。常規(guī)檢測全血 樣本雖然在強陽性樣本存在的情況下有不錯的相關性，但是斜率遠小于1，表明了其準確度 不夠，在0.05ng/ml以下的濃度時會產生很大程度上的假陽性。因此對醫(yī)生的判斷造成了 干擾。該發(fā)明的全血處理試劑盒處理后檢測全血樣本中PCT含量的相關性和斜率均要優(yōu)于 常規(guī)測試，這一現(xiàn)象尤其在< 0. 5ng/ml的低值處尤為明顯，這給醫(yī)生對病人提供治療方案 起到了積極作用。本發(fā)明提供的這種利用免疫反應及磁性分離快速去除紅細胞的方法，操 作簡單，可大幅縮短紅細胞去除的時間，并大大減少了溶血現(xiàn)象的發(fā)生，且可應用于全自動 和半自動化學發(fā)光儀，配合相應的體外診斷試劑盒進行全血樣本的檢測。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供了一種利用免疫反應及磁性分 離快速去除紅細胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種樣本處理試劑盒，可以解決傳統(tǒng)的化學發(fā)光試劑無 法實現(xiàn)全血檢測的問題。
[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)：
[0009] -種利用免疫反應及磁性分離快速去除紅細胞的方法。其通過羊抗人血紅細胞抗 體與血紅細胞發(fā)生抗原抗體反應形成紅細胞-羊抗人血紅細胞抗體復合體產生凝集，這種 復合體被包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球捕獲，進而通過磁性分離達到去除 紅細胞的目的。該發(fā)明可應用于全自動和半自動化學發(fā)光儀，以便于實現(xiàn)化學發(fā)光法體外 診斷試劑盒檢測全血樣本。
[0010] 所述的羊抗人血紅細胞的抗體為可特異性識別血紅細胞的單抗。
[0011] 所述的鼠抗羊Fc端的單克隆抗體為可特異性識別羊多抗的Fc端的鼠單克隆抗 體。
[0012] 所述用于包被鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球，是指粒徑在0. 2-50 μ m之 間，表面修飾羧基、氨基、氯甲基等化學功能基團的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
[0013] 一種全血處理試劑盒，包括A液：含羊抗人血紅細胞抗體的緩沖液；B液：共價偶 聯(lián)了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球懸浮液。
[0014] 所述的A液中儲存抗體緩沖液的組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN 3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0015] 所述的B液中儲存磁珠的緩沖液組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0016] 上述檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0017] 1)配制 20mM PBS緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1% 的P300,5mg/ml BSA，pH7. 4， 構成抗體的儲存液。
[0018] 2)配制 50mM Tris 緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1 % 的 P300,5mg/ml BSA， pH7. 6,構成磁珠儲存液。
[0019] 3)制備共價偶聯(lián)了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微粒：用活化緩沖液活化納 米粒表面化學基團，活化完成后使用偶聯(lián)緩沖液清洗磁性微粒，加入相當于磁性微粒質量 的1/20的單克隆抗體，反應后使用封閉緩沖液封閉納米粒上空余的活化基團，既得鼠抗羊 Fc磁性微粒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為常規(guī)方法檢測全血樣本PCT含量
[0021] 圖2為使用本發(fā)明方法檢測全血樣本PCT含量
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的描述，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實施例
[0024] 1.實驗目的：
[0025] 驗證本發(fā)明所闡述的快捷去除紅細胞的方法輔助化學發(fā)光體外診斷試劑盒檢測 全血樣本中的應用。
[0026] 2.實驗器材和試劑：
[0027] 化學發(fā)光儀（深圳新產業(yè)maglumi)，恒溫水浴鍋（HH-60,常州國華電器有限公 司），微量移液器（Thermo公司），磁性分離架（天津倍思樂色譜技術開發(fā)中心）。PCT校 準品（Audit 公司），PBS-T 緩沖液（KH2P04 3. 35g/L，Na2HP04-12H20 17. 9g/L，KC1 0· 2g/L， NaC18. 77g/L，Tween-20 (λ 5g/L，ρΗ7· 2)，PCT 校準品稀釋液為含 20%牛血清的 PBS-T 緩沖 液，PCT檢測試劑盒（深圳新產業(yè)），全血處理試劑盒的制備同說明書中闡述的制備方法。
[0028] 3.實驗步驟：
[0029] 3. 1收集50份已知PCT濃度的血液樣本，其中含20份陽性血液標本和30份陰性 血液標本。
[0030] 3. 2. 1常規(guī)PCT試劑盒檢測全血樣本
[0031] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，按照PCT檢測試劑盒說 明書中的要求進行操作。
[0032] 3. 2. 2樣本經過該發(fā)明的全血處理試劑盒處理后檢測
[0033] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，加入40微升A液，充分 混勻，37°C溫育1分鐘；加入10微升B液，充分混勻，37°C溫育5分鐘，進行磁性分離，將上 清吸出，按照PCT檢測試劑盒說明書中的要求操作該上清。
【權利要求】
1. 一種有效分離血紅細胞的方法，該方法可快速有效的去除血液樣本中的紅細胞，并 減少溶血現(xiàn)象的發(fā)生。
2. 根據權利要求1所述的分離血紅細胞的方法，其特征在于涉及到免疫凝集、免疫吸 附及磁性分尚技術。
3. 根據權利要求2所述的免疫凝集，其特征在于羊抗人血紅細胞抗體與紅細胞發(fā)生抗 原抗體反應形成紅細胞-羊抗人血紅細胞抗體復合體，產生凝集。
4. 根據權利要求2所述的免疫吸附和磁性分離技術，其特征在于包被有鼠抗羊Fc端單 克隆抗體的磁性微球捕獲免疫凝集之后的復合體，在外加磁場的作用下將復合體從血漿中 分離出來。
5. 根據權利要求4所述的磁性微球，其特征在于直徑為0. 2-50 μ m，表面修飾羧基、氨 基、氯甲基等化學功能基團的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
6. 根據權利要求1所述的快捷去除紅細胞的方法，其特征在于可大幅縮短紅細胞去除 時間，并可與全自動及半自動化學發(fā)光儀配合，實現(xiàn)普通試劑盒的全血檢測。
【文檔編號】G01N33/577GK104111333SQ201310571230
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權日:2013年11月13日
【發(fā)明者】葉森 申請人:葉森
專業(yè)數(shù)控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
