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一種酶傳感器的制備方法及其測定過氧化氫的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酶傳感器的制備方法及其測定過氧化氫的方法，該方法利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的高催化性能，碳納米管的信號增強作用。本發(fā)明通過電沉積把水滑石-酶負(fù)載在碳納米管修飾的基礎(chǔ)電極表面制備酶傳感器，通過簡單的電沉積法制備水滑石將辣根過氧化物酶固定于電極表面使酶緊密的負(fù)載在電極表面，有利于酶的固定和酶的直接電子傳遞。
【專利說明】一種酶傳感器的制備方法及其測定過氧化氫的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶傳感器和電分析化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種以水滑石為載體測定過氧化氫的酶傳感器的制備方法及其測定。
【背景技術(shù)】
[0002]水滑石是一類由帶正電荷的金屬氫氧化物及層和層間填充的可交換的陰離子所構(gòu)成的層狀化合物。由于水滑石具有強吸附性、比表面積大、生物相容性良好和離子交換性能好等特點，近年來一直受到人們的廣泛關(guān)注，并被應(yīng)用到酶傳感器中作為固定化酶的載體和化學(xué)修飾電極中作為修飾劑。但由于水滑石的弱導(dǎo)電性不利于水滑石修飾電極的電子傳遞，降低了電極材料的電化學(xué)性能，限制其在電化學(xué)領(lǐng)域的大力發(fā)展。最近，金納米粒子、碳納米管和石墨烯等具有良好導(dǎo)電性的納米材料引入到水滑石修飾電極中提高其電化學(xué)性能。如Wang等通過共沉淀方法制備金納米粒子-水滑石復(fù)合納米材料構(gòu)建測定甲醇的修飾電極，由于金納米粒子和水滑石的協(xié)同作用，該電極催化氧化甲醇的峰電流遠(yuǎn)大于水滑石修飾電極的峰電流(Wang Y., Zhang D., Tang M., Xu S.，Li M.Elec trochimi caActa, 2010, 55: 4045-4049.)。
[0003]碳納米管自發(fā)現(xiàn)以來，以它獨一無二的結(jié)構(gòu)、電化學(xué)和機械性能而備受關(guān)注，由于其直徑小，高表面能且原子配位不足，至使碳納米管的表面原子活性非常高，極易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用，由于其獨特的結(jié)構(gòu)，使其具有大的比表面積和較好的生物相容性，是良好的電化學(xué)納米材料。
[0004]過氧化氫是一種重要的化工產(chǎn)品，同時也參與過氧化物酶的酶促反應(yīng)，它在生物、環(huán)保、食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域的定量測定具有重要的意義。相對于傳統(tǒng)的過氧化氫測定方法如紫外-可見分光光度法、化學(xué)發(fā)光和熒光等方法，基于酶電極的電化學(xué)傳感器法，因其靈敏度高，響應(yīng)速度快、選擇性好的特點，受到廣大研究者的親睞。如Chen等通過滴涂法將辣根過氧化物酶和鎳鋁水滑石固定在玻碳電極表面，制備測定過氧化氫的酶傳感器(ChenX.，F(xiàn)u C., Wang Y.，Yang W.，Evans D.G.，Biosensors and Bioelectronics, 2008，24: 356-361 )，但由于在固定化酶的方法上的缺點，使酶很容易脫落，受環(huán)境的影響大，限制了它的應(yīng)用。
[0005]目前，以水滑石為固定化酶的載體制備辣根過氧化物酶傳感器并用于檢測過氧化氫的報道，都是先通過共沉淀法或水熱法合成水滑石，然后采用滴涂法或?qū)訉咏M裝法制備辣根過氧化物酶傳感器。上述方法繁瑣、復(fù)雜費時，本發(fā)明專利通過簡單的電沉積法將辣根過氧化物酶固定在水滑石載體上制備辣根過氧化物酶傳感器，通過簡單的電沉積法制備水滑石將辣根過氧化物酶固定于電極表面使酶緊密的負(fù)載在電極表面，有利于酶的固定化和酶的直接電子傳遞；另外，本發(fā)明專利將碳納米管的引入到基礎(chǔ)電極表面，改善水滑石修飾電極的導(dǎo)電性而提高酶傳感器的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是，針對目前以水滑石為載體制備辣根過氧化物酶傳感器的方法復(fù)雜、繁瑣及水滑石修飾電極的導(dǎo)電性差的缺點，通過簡單的一步電沉積法在碳納米管修飾基礎(chǔ)電極表面制備了以水滑石為載體的辣根過氧化物酶傳感器并用于檢測過氧化氫。
[0007]實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是，本發(fā)明通過滴涂的方法先將碳納米管修飾于電極表面，然后通過一步電沉積法將水滑石和辣根過氧化物酶固定在碳納米管修飾的電極表面，利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的催化還原和酶的直接電子傳遞，建立了一種新的測定過氧化氫的方法。
[0008]本發(fā)明以水滑石為載體制備酶傳感器的制備方法，所述方法步驟如下:
(I)用微量注射器取2?15 μ I分散好的0.3?2.0 mg/mL碳納米管懸浮液均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到碳納米管修飾電極。
[0009](2)先配制含硝酸鉆15?25 mmol/L、硝酸招5?10 mmol/L、硝酸鐘0.1?0.5mol/L和辣根過氧化物酶0.3?1.5 mg/mL的電沉積液，然后將碳納米管修飾電極置于電沉積液中于-0.6?-1.2 V下進行恒電位沉積，時間為10?80s，沉積結(jié)束之后用去離子水沖洗干凈，得到水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，該辣根過氧化物酶修飾電極即為測定過氧化氫的酶傳感器。
[0010]本發(fā)明以水滑石為載體制備酶傳感器檢測過氧化氫的方法如下:
本發(fā)明利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的催化還原和酶與電極之間的直接電子傳遞，將前述辣根過氧化物酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，即可實現(xiàn)對過氧化氫的檢測。
[0011]該傳感器測定過氧化氫的線性范圍為2.5X10_6?7.85X10_4 mol/L，檢測限為1.6X10-6 mol/L，靈敏度為0.00881 A.1Vmol。用同一批制備的5支修飾電極對0.25mmol/L H2O2進行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%。采用同一支修飾電極對過氧化氫進行5次檢測，其對過氧化氫響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%。酶修飾電極在0.25mmol/L H2O2置于4 °C的環(huán)境中考察其穩(wěn)定性，四周后，仍保留響應(yīng)電流值的83%。表明該電極具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
[0012]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明利用碳納米管的大比表面積、良好的導(dǎo)電性和生物相容性，通過一步電沉積法在碳納米管修飾的基礎(chǔ)電極表面將辣根過氧化物酶負(fù)載在水滑石上實現(xiàn)了酶的直接電化學(xué)并用于測定過氧化氫。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明中的酶修飾電極在0.2 mol/L PBS (pH 7.0)中的循環(huán)伏安圖，(a)未加過氧化氫，(b)加入125 μ mol/L過氧化氫；
圖2為本發(fā)明中不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線，(a)水滑石修飾電極，(b)水滑石/碳納米管修飾電極，(c)辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，Cd)水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極；
圖3為酶修飾電極對過氧化氫的計時電流曲線；
圖4酶修飾電極的電流響應(yīng)對過氧化氫濃度的校準(zhǔn)曲線?！揪唧w實施方式】
[0014]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，以下實施例有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但決不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0015]實施例1
以水滑石為載體制備酶傳感器。
[0016](I)用微量注射器取3μ I分散好的0.5 mg/mL碳納米管懸浮液均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到碳納米管修飾電極。
[0017](2)先配制含硝酸鈷15 mmol/L、硝酸招5 mmol/L、硝酸鉀0.1 mol/L和辣根過氧化物酶0.3 mg/mL的電沉積液，然后將碳納米管修飾電極置于電沉積液中于-0.6 V下進行恒電位沉積，時間為80s，沉積結(jié)束之后用去離子水沖洗干凈，得到水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，該辣根過氧化物酶修飾電極即為測定過氧化氫的酶傳感器。
[0018]實施例2
以水滑石為載體制備酶傳感器。
[0019](I)用微量注射器取5μ I分散好的0.5 mg/mL碳納米管懸浮液均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到碳納米管修飾電極。
[0020](2)先配制含硝酸鈷21 mmol/L、硝酸鋁7 mmol/L、硝酸鉀0.2 mol/L和辣根過氧化物酶0.5 mg/mL的電沉積液，然后將碳納米管修飾電極置于電沉積液中于-0.8 V下進行恒電位沉積，時間為70s，沉積結(jié)束之后用去離子水沖洗干凈，得到水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，該辣根過氧化物酶修飾電極即為測定過氧化氫的酶傳感器。
[0021]實施例3
以水滑石為載體制備酶傳感器。
[0022]I)用微量注射器取5 μ I分散好的1.0 mg/mL碳納米管懸浮液均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到碳納米管修飾電極。
[0023](2)先配制含硝酸鈷22.5 mmol/L、硝酸鋁7.5 mmol/L、硝酸鉀0.3 mol/L和辣根過氧化物酶1.0 mg/mL的電沉積液，然后將碳納米管修飾電極置于電沉積液中于-0.9 V下進行恒電位沉積，時間為30s，沉積結(jié)束之后用去離子水沖洗干凈，得到水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，該辣根過氧化物酶修飾電極即為測定過氧化氫的酶傳感器。
[0024]實施例4 電化學(xué)測試。
[0025]將實施例3得到的酶修飾電極進行電化學(xué)測試:
(I)酶修飾電極的循環(huán)伏安測試。
[0026]酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為
0.2 mol/L PBS (pH 7.0)和加了 125 μ mol/L的過氧化氫；掃描速度為0.1 V/s。循環(huán)伏安圖見圖1，從圖1可見，加入過氧化氫后，還原峰的峰電流增大，氧化峰的峰電流減小，說明酶修飾電極對過氧化氫產(chǎn)生了催化還原，催化電流是由酶電極中的辣根過氧化物酶催化還原過氧化氫產(chǎn)生的。
[0027](2)不同修飾電極的循環(huán)伏安表征。
[0028]分別將水滑石修飾電極、水滑石/碳納米管修飾電極、辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極和水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為0.2 mol/L PBS (pH 7.0)，電位范圍為0.4~-0.8V，掃速為100m V/s;循環(huán)伏安測定結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，直接電沉積了水滑石的修飾電極(曲線a)在此電位區(qū)間是沒有明顯的氧化還原峰出現(xiàn)；而水滑石/碳納米管修飾電極(曲線b)出現(xiàn)了一對較小的氧化還原峰，這是在電極表面修飾了一層碳納米管而出現(xiàn)的峰，此時由于碳納米管的 作用，使其充電電流變大；辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極(曲線c)是在碳納米管表面滴加了一層辣根過氧化物酶之后，在-0.097V和-0.293V出現(xiàn)一對明顯的可逆氧化還原峰，這是辣根過氧化物酶在PBS溶液中的Fe ( II ) /Fe(III)氧化還原所產(chǎn)生的可逆峰，但通過滴涂法使辣根過氧化物酶固定在碳納米管表面的方法在進行電化學(xué)檢測時容易脫落，會導(dǎo)致實驗的穩(wěn)定性差；水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極(曲線d)通過電沉積水滑石法固定辣根過氧化物酶于碳納米管修飾電極表面，使酶的氧化還原峰電流變得更大，并且也保證了實驗的穩(wěn)定性。
[0029](3)酶修飾電極的計時電流測試
將水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；底液為0.2 mol/L PBS (pH 7.0);測定電位為-0.3 V，在磁力攪拌下，連續(xù)滴加一定濃度的過氧化氫，測定結(jié)果見圖3、圖4。測定過氧化氫的線性范圍為2.5Χ10-6 ~7.85X1(T4 mol/L，檢測限為 1.6 X 1(T6 mol/L，靈敏度為 0.00881 A.L/mol。平行測定5次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，四周后測定過氧化氫的響應(yīng)電流保持在83%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述方法的具體步驟為: (1)用微量注射器取2?15μ I分散好的0.3?2.0 mg/mL碳納米管懸浮液均勻的滴加在干凈的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，用去離子水沖洗干凈，得到碳納米管修飾電極； (2)先配制含硝酸鉆15?25mmol/L、硝酸招5?10 mmol/L、硝酸鐘0.1?0.5 mol/L和辣根過氧化物酶0.3?1.5 mg/mL的電沉積液，然后將碳納米管修飾電極置于電沉積液中于-0.6?-1.2 V下進行恒電位沉積，時間為10?80s，沉積結(jié)束之后用去離子水沖洗干凈，得到水滑石-辣根過氧化物酶/碳納米管修飾電極，該辣根過氧化物酶修飾電極即為測定過氧化氫的酶傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述電沉積液為含硝酸鈷15?25 mmol/L、硝酸招5?10 mmol/L、硝酸鉀0.1?0.5 mol/L和辣根過氧化物酶 0.3 ?1.5 mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述電沉積條件為-0.6?-1.2 V下進行恒電位沉積，時間為10?80s。
4.一種以水滑石為載體的酶傳感器檢測過氧化氫的方法，其特征在于，所述方法利用辣根過氧化物酶對過氧化氫的催化性能，碳納米管的信號增強作用，辣根過氧化物酶的直接電子傳遞等特性，將辣根過氧化物酶修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，實現(xiàn)對過氧化氫的靈敏檢測。
【文檔編號】G01N27/30GK103954666SQ201410212146
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】楊紹明, 陳愛喜, 孫清, 李瑞琴, 尚培玲 申請人:華東交通大學(xué)