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一種金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用，涉及金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用的領(lǐng)域。本發(fā)明解決了現(xiàn)有熒光免疫分析中背景噪聲大、檢測靈敏度低的問題。一種金屬納米島載體是在載體材料表面形成金屬納米島而得到的。制備方法：一、在載體材料表面吸附金納米種子；二、配置生長金屬納米島反應(yīng)液；三、在載體材料表面生長金屬納米島；四、清洗、干燥。金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，使用金屬納米島載體作為捕獲分子的修飾載體制成生物芯片，進(jìn)行熒光掃描和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而完成免疫檢測。本發(fā)明具有高靈敏度、大大降低背景熒光噪聲，實(shí)現(xiàn)了fm級的超靈敏檢測。本發(fā)明適用于功能材料、生物芯片和免疫檢測領(lǐng)域。
【專利說明】一種金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]體液免疫檢查在在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病早期診斷中具有極為重要的研究價值，尤其是實(shí)現(xiàn)對心腦血管、癌癥等一系列重大疾病的早期檢測和篩查的關(guān)鍵所在。然而要實(shí)現(xiàn)對這些體液中較低濃度目標(biāo)分子的分析檢測，現(xiàn)有的免疫檢測技術(shù)如放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、熒光免疫分析(FIA)、膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)還存在著靈敏度低、特異性差等一些問題。尤其是熒光免疫檢測技術(shù)，雖然理論上能夠?qū)崿F(xiàn)對單分子水平的標(biāo)記，但由于受到生物分子背熒光、激光散射噪聲等影響而嚴(yán)重降低了其檢測靈敏度(通常只能到幾十Pg數(shù)量級)。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的熒光免疫分析中背景噪聲大、檢測靈敏度低的問題，而提供了一種金屬納米島載體及其制備方法和在免疫檢測中的應(yīng)用。
[0004]—種金屬納米島載體，是在載體材料表面形成金屬納米島而得到的，所述的金屬納米島是分立的，所述的金屬納米島的尺寸為10?500nm,所述的金屬納米島之間的間隙為 5 ?200nm。
[0005]所述的載體材料為固相材料或懸浮材料。
[0006]所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)。
[0007]所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜。
[0008]所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
[0009]所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。
[0010]制備金屬納米島載體的方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0011]一、在載體材料表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載體材料；
[0012]二、配置生長金屬納米島的反應(yīng)溶液:將還原劑加入到含有金屬離子的溶液中，混合均勻；其中，所述的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.5?2): I ;所述的金屬離子的溶液的濃度為0.1?5mM ；
[0013]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載體材料放入步驟二中得到的生長金屬納米島的反應(yīng)溶液中，在18?30°C下振蕩反應(yīng)2?60min ；
[0014]四、將步驟三中反應(yīng)完成的載體材料取出，用水清洗，干燥，即得到金屬納米島載體。
[0015]所述的步驟一中的金納米種子是通過化學(xué)還原法還原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)相互作用結(jié)合到載體材料表面的。[0016]所述的步驟一中的載體材料表面吸附的金納米種子的粒徑為I?20nm。
[0017]所述的步驟一中的載體材料為固相材料或懸浮材料。
[0018]所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)。
[0019]所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜。
[0020]所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
[0021]所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。
[0022]所述的步驟二中的還原劑為NaBH4, NH2OH, N2H4, CH2O或C6H1206。
[0023]所述的金屬離子溶液為Ag+溶液或Au3+溶液中的一種或兩種的混合溶液。
[0024]所述的步驟二中的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.7?1.5): I。
[0025]所述的步驟二中的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為1:1。
[0026]所述的步驟二中的金屬離子的溶液的濃度為0.3?5mM。
[0027]所述的步驟二中的金屬離子的溶液的濃度為0.5?ImM。
[0028]所述的步驟四中的水為去離子水。
[0029]金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，是生物芯片中的捕獲分子捕獲相應(yīng)的物質(zhì)，進(jìn)行熒光掃描和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而完成免疫檢測，其中使用所述金屬納米島載體作為捕獲分子的修飾載體制成生物芯片。
[0030]所述的金屬納米島載體表面修飾腫瘤標(biāo)志物抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用。
[0031]所述的金屬納米島載體表面修飾自體免疫疾病相關(guān)的抗原、抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在自體免疫疾病檢測中的應(yīng)用。
[0032]所述的金屬納米島載體表面修飾乙肝抗體分子、流感病毒DNS序列、結(jié)合病抗體、瘧原蟲抗原(或抗體)、大腸桿菌抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在傳染性疾病的檢測中的應(yīng)用。
[0033]所述的金屬納米島載體表面修飾白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子或生長因子的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞因子的檢測中的應(yīng)用。
[0034]所述的金屬納米島載體表面修飾對不同疾病的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在對捕獲的目標(biāo)細(xì)胞分泌物進(jìn)行Elispot檢測中的應(yīng)用。
[0035]所述的生物芯片為微陣列生物芯片或懸浮式生物芯片。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):一、本發(fā)明是基于濕化學(xué)合成方法，通過金納米種子誘導(dǎo)的原位還原生長過程在載體材料表面實(shí)現(xiàn)了不同種類金屬納米島功能載體的制備，并進(jìn)一步利用制備的金屬納米島載體表面等離子體共振效應(yīng)進(jìn)行高靈敏度的免疫檢測分析，尤其是利用近紅外熒光增強(qiáng)技術(shù)大大降低了背景熒光噪聲，實(shí)現(xiàn)了 fm級的超靈敏檢測；
[0037]二、本發(fā)明是通過控制金屬的種類以及納米島的尺寸、形貌、間距等來實(shí)現(xiàn)調(diào)控金屬納米島載體的等離子體共振吸收峰的連續(xù)可調(diào)，涵蓋了從可見光到近紅外區(qū)域(420?1700nm)的一系列波段，滿足免疫檢測的需求。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0038]圖1為試驗(yàn)一的載玻片銀納米島載體的掃描電子顯微鏡圖；[0039]圖2為試驗(yàn)三的載玻片銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體的掃描電子顯微鏡圖；
[0040]圖3為試驗(yàn)一的載玻片銀納米島載體和試驗(yàn)三的載玻片銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體的等離子吸收光譜曲線對比圖；
[0041]圖4為普通玻璃、試驗(yàn)一的載玻片銀納米島載體和試驗(yàn)三的載玻片銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體的熒光掃描對比圖；
[0042]圖5為普通玻璃和試驗(yàn)一的載玻片銀納米島載體表面熒光強(qiáng)度的對比圖；
[0043]圖6為試驗(yàn)五中步驟一得到的聚苯乙烯微球的掃描電子顯微鏡圖；
[0044]圖7為試驗(yàn)六中步驟一得到的磁性聚苯乙烯微球和試驗(yàn)六中步驟五得到的磁性聚苯乙烯微球金納米島載體在磁鐵富集作用前后的效果對比圖；
[0045]圖8為試驗(yàn)六得到的磁性聚苯乙烯微球金納米島載體的紫外吸收光譜圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0046]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0047]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式是一種金屬納米島載體，是在載體材料表面形成金屬納米島而得到的，所述的金屬納米島是分立的，所述的金屬納米島的尺寸為10?500nm,所述的金屬納米島之間的間隙為5?200nm。
[0048]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一的不同點(diǎn)是:所述的載體材料為固相材料或懸浮材料。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0049]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二的不同點(diǎn)是:所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)。其它與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0050]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一的不同點(diǎn)是:所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜。其它與【具體實(shí)施方式】一至三相同。
[0051]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一的不同點(diǎn)是:所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。其它與【具體實(shí)施方式】一至四相同。
[0052]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。其它與【具體實(shí)施方式】一至五相同。
[0053]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式是制備金屬納米島載體的方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0054]一、在載體材料表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載體材料；
[0055]二、配置生長金屬納米島的反應(yīng)溶液:將還原劑加入到含有金屬離子的溶液中，混合均勻；其中，所述的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.5?2): I;所述的金屬離子的溶液的濃度為0.1?5mM ；
[0056]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載體材料放入步驟二中得到的生長金屬納米島的反應(yīng)溶液中，在18?30°C下振蕩反應(yīng)2?60min ；
[0057]四、將步驟三中反應(yīng)完成的載體材料取出，用水清洗，干燥，即得到金屬納米島載體。
[0058]所述的金屬納米島功能載體是通過金納米種子誘導(dǎo)的原位化學(xué)還原生長實(shí)現(xiàn)的。
[0059]所述的單位mM為mmol / L。
[0060]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七的不同點(diǎn)是:所述的步驟一中的金納米種子是通過化學(xué)還原法還原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)相互作用結(jié)合到載體材料表面的。其它與【具體實(shí)施方式】七相同。
[0061]所述的步驟一中的操作方法，具體按照以下步驟完成的:
[0062]a、將Iml的THPC還原劑加入到含有ImM NaOH的水溶液中，劇烈攪拌30min，待用；b、向步驟a中迅速注入ImL的AuHCl4溶液,室溫下劇烈攪拌反應(yīng)30min ;c、將得到的金納米種子溶液置于室溫下避光熟化24h ;d、將載體材料放入步驟c得到的金納米種子溶液中，室溫下反應(yīng)10~300min,即得到表面吸附金納米種子的載體材料
[0063]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至八之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟一中的載體材料表面吸附的金納米種子的粒徑為I~20nm。其它與【具體實(shí)施方式】七至八相同。[0064]【具體實(shí)施方式】十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至九之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟一中的載體材料為固相材料或懸浮材料。其它與【具體實(shí)施方式】七至九相同。
[0065]【具體實(shí)施方式】十一:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十之一的不同點(diǎn)是:所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)。其它與【具體實(shí)施方式】七至十相同。
[0066]【具體實(shí)施方式】十二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十一之一的不同點(diǎn)是:所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜。其它與【具體實(shí)施方式】七至十一相同。
[0067]【具體實(shí)施方式】十三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十二之一的不同點(diǎn)是:所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。其它與【具體實(shí)施方式】七至十二相同。
[0068]【具體實(shí)施方式】十四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十三之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。其它與【具體實(shí)施方式】七至十三相同。
[0069]【具體實(shí)施方式】十五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十四之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟二中的還原劑為NaBH4,NH2OH,N2H4, CH2O或C6H1206。其它與【具體實(shí)施方式】七至十四相同。
[0070]【具體實(shí)施方式】十六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十五之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬離子溶液為Ag+溶液或Au3+溶液中的一種或兩種的混合溶液。其它與【具體實(shí)施方式】七至十五相同。
[0071]【具體實(shí)施方式】十七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十六之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟二中的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.7~1.5): I其它與【具體實(shí)施方式】七至十六相同。
[0072]【具體實(shí)施方式】十八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十七之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟二中的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為1:1。其它與【具體實(shí)施方式】七至十七相同。
[0073]【具體實(shí)施方式】十九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十八之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟二中的金屬離子的溶液的濃度為0.3~5mM。其它與【具體實(shí)施方式】七至十八相同。
[0074]【具體實(shí)施方式】二十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至十九之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟二中的金屬離子的溶液的濃度為0.5~ImM。其它與【具體實(shí)施方式】七至十九相同。
[0075]【具體實(shí)施方式】二十一:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】七至二十之一的不同點(diǎn)是:所述的步驟四中的水為去離子水。其它與【具體實(shí)施方式】七至二十相同。
[0076]【具體實(shí)施方式】二十二:本實(shí)施方式是一種金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，是生物芯片中的捕獲分子捕獲相應(yīng)的物質(zhì)，進(jìn)行熒光掃描和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而完成免疫檢測，其中使用所述金屬納米島載體作為捕獲分子的修飾載體制成生物芯片。
[0077]【具體實(shí)施方式】二十三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二的不同點(diǎn)是:所述的金屬納米島載體表面修飾腫瘤標(biāo)志物抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用。其它與【具體實(shí)施方式】二十二相同。
[0078]【具體實(shí)施方式】二十四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二或二十三的不同點(diǎn)是:所述的金屬納米島載體表面修飾自體免疫疾病相關(guān)的抗原、抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在自體免疫疾病檢測中的應(yīng)用。其它與【具體實(shí)施方式】二十二或二十三相同。
[0079]【具體實(shí)施方式】二十五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二至二十四之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬納米島載體表面修飾乙肝抗體分子、流感病毒DNS序列、結(jié)合病抗體、瘧原蟲抗原(或抗體)、大腸桿菌抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在傳染性疾病的檢測中的應(yīng)用。其它與【具體實(shí)施方式】二十二至二十五相同。
[0080]【具體實(shí)施方式】二十六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二至二十五之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬納米島載體表面修飾白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子或生長因子的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞因子的檢測中的應(yīng)用。其它與【具體實(shí)施方式】二十二至二十五相同。
`[0081]【具體實(shí)施方式】二十七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二至二十六之一的不同點(diǎn)是:所述的金屬納米島載體表面修飾對不同疾病的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在對捕獲的目標(biāo)細(xì)胞分泌物進(jìn)行Elispot檢測中的應(yīng)用。其它與【具體實(shí)施方式】二十二至二十六相同。
[0082]【具體實(shí)施方式】二十八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二十二至二十七之一的不同點(diǎn)是:所述的生物芯片為微陣列生物芯片或懸浮式生物芯片。其它與【具體實(shí)施方式】二十二至二十七相同。
[0083]采用下述試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果:
[0084]試驗(yàn)一:銀納米島載體，在載玻片表面形成銀納米島而得到的，所述的銀納米島是分立的，所述的銀納米島的平均尺寸在100~500nm之間，所述的銀納米島之間的間隙為30 ~IOOnm0
[0085]銀納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0086]一、在載玻片表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載玻片；
[0087]二、配置生長銀納米島的反應(yīng)溶液:將CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均勻；其中，所述的CH2O與AgNO3的摩爾比為0.5:1 ;所述的AgNO3溶液的摩爾濃度為ImM ；
[0088]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載玻片放入步驟二中得到的生長銀納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下反應(yīng)30min ；[0089]四、將步驟三中反應(yīng)完成的載玻片取出，用水清洗，干燥，即得到銀納米島載體。
[0090]對試驗(yàn)一得到的銀納米島載體進(jìn)行掃描電子顯微鏡測試，得到圖1。圖1為試驗(yàn)一的銀納米島載體的掃描電子顯微鏡圖。從圖1中，可以看出銀納米島的平均尺寸在100?500nm之間，銀納米島之間的間隙為30?IOOnm。
[0091]試驗(yàn)二:金-銀合金納米島載體，在載玻片表面形成金-銀合金納米島而得到的，所述的金-銀合金納米島是分立的，所述的金-銀合金納米島的平均尺寸在100?500nm之間，所述的金-銀合金納米島之間的間隙為30?lOOnm。
[0092]金-銀合金納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0093]一、在載玻片表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載玻片；
[0094]二、配置生長金-銀合金納米島的反應(yīng)溶液:將NH2OH加入到AgNO3溶液和AuHCl4溶液的混合溶液中，混合均勻；其中，所述的NH2OH與AgNO3的摩爾比為2: I ;所述的AuHCl4與AgNO3的摩爾比為1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩爾濃度為0.5mM ;所述的AuHCl4溶液的摩爾濃度為0.5mM ；
[0095]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載玻片放入步驟二中得到的生長金-銀合金納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下震蕩反應(yīng)30分鐘；
[0096]四、將步驟三中反應(yīng)完成的載玻片取出，用水清洗，干燥，即得到金-銀合金納米島載體。
[0097]試驗(yàn)三:銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體
[0098]銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體，在載玻片表面形成銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島而得到的，所述的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島是分立的，所述的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島的平均尺寸在100?500nm之間,所述的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島之間的間隙為30?lOOnm。
[0099]銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0100]一、在載玻片表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載玻片；
[0101]二、配置生長銀納米島的反應(yīng)溶液:將CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均勻；其中，所述的CH2O與AgNO3的摩爾比為1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩爾濃度為ImM ；
[0102]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載玻片放入步驟二中得到的生長銀納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下反應(yīng)30min ；
[0103]四、將步驟三中得到的載玻片放入AuHCl4溶液中，繼續(xù)反應(yīng)I小時，使銀納米島表面包覆一層金納米殼層；所述的AuHCl4溶液的摩爾濃度為10 μ M ;
[0104]五、將步驟四中反應(yīng)完成的載玻片取出，用水清洗，干燥，即得到銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體。
[0105]對試驗(yàn)三得到的銀納米島載體進(jìn)行掃描電子顯微鏡測試，得到圖2。圖2為試驗(yàn)三的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體的掃描電子顯微鏡圖。從圖2中，可以看出銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島的平均尺寸在100?500nm之間，銀納米島之間的間隙為30?lOOnm。
[0106]對試驗(yàn)一得到的銀納米島載體和試驗(yàn)三得到的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體進(jìn)行等離子吸收光譜測試，得到圖3。圖3是等離子吸收光譜曲線；其中，實(shí)線為銀納米島載體等離子吸收光譜曲線，虛線為銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體等離子吸收光譜曲線。從圖3中，可以得到兩個載體的吸收峰分別位于450nm和420nm附近，OD值為0.60上下，可以看出包覆金殼層會引起銀本征等離子吸收峰的變化，因此理論上通過改變銀-金納米島的化學(xué)計(jì)量比和結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)等其離子共振吸收峰從可見光到近紅外區(qū)的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)對寬光譜范圍的熒光增強(qiáng)和超靈敏免疫檢測分析。
[0107]對普通玻璃、試驗(yàn)一得到的銀納米島載體和試驗(yàn)三得到的銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島載體進(jìn)行熒光強(qiáng)度測試。測試方法:采用Cy5.5標(biāo)記的BSA按一定的濃度梯度在普通玻璃和銀納米島及銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島等不同載體上進(jìn)行了點(diǎn)樣測試:100，10，1,0.1,0.01，Oug/ ml,然后用商品化的Odyssey突光掃描儀(Licor)進(jìn)行分析,掃描結(jié)果如圖4所示。從圖4中，可以觀察到銀納米島載體和銀/金核殼結(jié)構(gòu)納米島都有明顯的熒光增強(qiáng)效果。將此圖片通過分析軟件測量后得到的普通玻璃和銀納米島載體表面熒光強(qiáng)度信號結(jié)果如圖5所示；其中，為普通玻璃，▲為銀納米島載體。從圖5中，可以觀察到銀納米島載體相對于普通玻璃的熒光強(qiáng)度約增強(qiáng)了 10倍，檢測限約提高了 2個量級。
[0108]試驗(yàn)四:玻璃微珠銀納米島載體
[0109]玻璃微珠銀納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0110]一、將玻璃微珠加入到金納米種子溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)30min，然后離心清洗3次，得到了表面吸附金納米種子的玻璃微珠；
[0111]二、配置生長銀納米島的反應(yīng)溶液:將CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均勻；其中，所述的CH2O與AgNO3的摩爾比為1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩爾濃度為0.5mM ；
[0112]三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的玻璃微珠放入步驟二中得到的生長銀納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下反應(yīng)60min ；
[0113]四、將步驟三中反應(yīng)完成的玻璃微珠離心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到玻璃微珠銀納米島載體。
[0114]試驗(yàn)五:聚苯乙烯微球銀納米島載體
[0115]聚苯乙烯微球銀納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0116]—、利用分散聚合法制備聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球尺寸均勻，直徑約為3.5 μ m ；
[0117]二、將聚苯乙烯微球加入到金納米種子溶液中，室溫下攪拌12小時，使材料表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的聚苯乙烯微球；
[0118]三、配置生長銀納米島的反應(yīng)溶液:將CH2O加入到AgNO3溶液中，混合均勻；其中，所述的CH2O與AgNO3的摩爾比為1:1 ;所述的AgNO3溶液的摩爾濃度為0.5mM ；
[0119]四、將步驟二中得到的表面吸附一層金納米種子的聚苯乙烯微球放入步驟三中得到的生長銀納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下反應(yīng)60min ；
[0120]五、將步驟四中反應(yīng)完成的聚苯乙烯微球離心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到聚苯乙烯微球銀納米島載體。
[0121]對試驗(yàn)五中步驟一得到的聚苯乙烯微球進(jìn)行掃描電子顯微鏡的測試，得到圖6。從圖6中，可以觀察到制備得到的聚苯乙烯微球的尺寸分布非常均勻，直徑約為3.5μπι。
[0122]試驗(yàn)六:磁珠金納米島載體
[0123]磁珠銀納米島載體的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的: [0124]一、制備磁性Fe3O4納米粒子，并將其吸附到聚苯乙烯小球表面，得到磁珠；
[0125]二、將磁珠加入到金納米種子溶液中，室溫下攪拌12小時，使材料表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的磁珠；[0126]三、配置生長金納米島的反應(yīng)溶液:將NH2OH加入到AuHCl4溶液中，混合均勻；其中，所述的NH2OH與AuHCl4的摩爾比為1:1 ;所述的AuHCl4溶液的摩爾濃度為ImM ；
[0127]四、將步驟二中得到的表面吸附一層金納米種子的磁珠放入步驟三中得到的生長金納米島的反應(yīng)溶液中，在20°C下攪拌反應(yīng)60min ；
[0128]五、將步驟四中反應(yīng)完成的磁珠離心，用水清洗，重新分散到水溶液中，即得到磁珠金納米島載體。
[0129]對試驗(yàn)六步驟一制備得到的磁性聚苯乙烯微球和試驗(yàn)六步驟五得到的磁性聚苯乙烯微球金納米島載體在磁鐵富集作用前后分別進(jìn)行了掃描電子顯微鏡測試，對比后得到圖7。從圖7中，可以看出磁性聚苯乙烯小球在吸附金納米種子功能載體后仍具有很強(qiáng)的磁富集效果。
[0130]對試驗(yàn)六得到的磁性聚苯乙烯微球金納米島載體進(jìn)行紫外吸收光譜測試，得到圖
8。從圖8中，可以觀察到在540nm處具有明顯的金等離子吸收峰，因此可以證明磁性聚苯乙烯小球表面可以吸附金納米種子，從而為后面進(jìn)一步生長金納米島膜提供材料支撐。
[0131]試驗(yàn)七:金屬納米島載體表面修飾腫瘤標(biāo)志物抗體分子制備成微陣列生物芯片在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用，具體操作方法如下:首先將12種不同的腫瘤標(biāo)志物抗體:糖類抗原CA19-9，糖類抗原CA125，癌胚抗原CEA，鐵蛋白Ferritin，人類絨毛膜性腺激素Beta-HCG,甲型胎兒蛋白AFP，前列腺等異性抗原PSA，生長激素HGH，糖類抗原CA15-3，神經(jīng)元特異烯醇化酶NSE等按不同的陣列修飾到金屬納米島功能載體表面，再利用5% BSA室溫下封閉2h，制備成微陣列生物芯片。然后將病人血清樣品滴加到芯片表面，抗體就會把相關(guān)的腫瘤標(biāo)志抗原捕獲在表面，最后加入熒光標(biāo)記的二抗，利用共聚焦掃描儀進(jìn)行熒光信號掃描和數(shù)據(jù)分析，即可快速完成對腫瘤的篩查。
[0132]試驗(yàn)八:金屬納米島載體制備成微陣列生物芯片在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的檢測中的應(yīng)用。(細(xì)胞因子分析)
[0133]紅斑狼瘡患者體內(nèi)存在多種自身抗體，95%以上病人抗核抗體陽性，可出現(xiàn)抗DNA (雙股、單股)、抗組蛋白、抗RNA —非組蛋白、抗核糖核蛋白(主要為Smith抗原)、抗粒細(xì)胞、抗血小板、抗平滑肌等抗體，其中抗雙股DNA和抗Smith抗原具相對特異性，陽性率分別為60%和30%，而在其他結(jié)締組織病的陽性率，均低于5%。利用玻片金屬納米島載體表面修飾相應(yīng)的單克隆抗體分子微陣列，制作生物芯片，實(shí)現(xiàn)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的檢測。
[0134]試驗(yàn)九:金屬納米島載體制備成微陣列生物芯片在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測中的應(yīng)用。(細(xì)胞因子分析)
[0135]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是常見的以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。檢測RA病人免疫球蛋白及補(bǔ)體，對了解RA患者體液免疫功能及在RA診斷、判斷預(yù)后及治療效果等方面的作用具有重要作用。利用金屬納米島載體表面修飾不同的單克隆抗體陣列，可以提高RA患者血清中的免疫球蛋白及補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗-CCP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、抗鏈球菌溶血素(ASO)的檢測靈敏度。
[0136]試驗(yàn)十:金屬納米島載體制備成微陣列生物芯片在乙型肝炎病毒的檢測中的應(yīng)用。(傳染病檢測)
[0137]HBsAg是乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白，是血清中首先出現(xiàn)的標(biāo)志物。在急性肝炎時它很快消失，若6個月以后仍不消失者，可成為慢性肝炎(CH)或HBsAg攜帶者，并可持續(xù)幾年或幾十年。HBsAg的檢測對于乙型肝炎的診斷和鑒別、流行病學(xué)的調(diào)查、獻(xiàn)血員的篩選、預(yù)后判斷及治療效果的考察和藥物的篩選具有重要的意義。在金屬納米島載體表面上包被HBs單抗，制備乙肝病毒檢測試劑盒，利用夾心法原理檢測血清中HBsAg。若樣本中含有HBsAg,則被載體表面結(jié)合,再加入突光標(biāo)記的抗HBs多抗,形成夾心復(fù)合物,最后通過掃描儀讀數(shù)，從而判定結(jié)果。
[0138] 試驗(yàn)十一:金屬納米島載體表面修飾腫瘤標(biāo)志物抗體分子制備成懸浮式生物芯片在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用，具體操作方法如下:首先在以不同尺寸的磁性聚苯乙烯小球等為基底制備金屬納米島功能載體，然后利用具有不同熒光發(fā)射的量子點(diǎn)(如600，700，SOOnm)分別對不同尺寸的聚苯乙烯小球進(jìn)行編碼，并在載體表面分別標(biāo)記針對不同檢測物的核酸、抗體、抗原等分子，從而實(shí)現(xiàn)對不同疾病的檢測。在捕獲目標(biāo)分子后用熒光標(biāo)記的二抗對微球進(jìn)行進(jìn)一步的標(biāo)記顯色，并利用自主研發(fā)的近紅外流式細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分子，最終給出診斷結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種金屬納米島載體，其特征在于:金屬納米島載體是在載體材料表面形成金屬納米島而得到的，所述的金屬納米島是分立的，所述的金屬納米島的尺寸為10~500nm,所述的金屬納米島之間的間隙為5~200nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬納米島載體，其特征在于所述的載體材料為固相材料或懸浮材料；所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)；所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜；所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。
3.一種制備金屬納米島載體的方法，其特征在于:制備方法具體是按照以下步驟進(jìn)行的: 一、在載體材料表面吸附一層金納米種子，得到了表面吸附金納米種子的載體材料； 二、配置生長金屬納米島的反應(yīng)溶液:將還原劑加入到含有金屬離子的溶液中，混合均勻；其中，所述的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.5~2): I ;所述的金屬離子的溶液的濃度為0.1~5mM ； 三、將步驟一中得到的表面吸附一層金納米種子的載體材料放入步驟二中得到的生長金屬納米島的反應(yīng)溶液中，在18~30°C下振蕩反應(yīng)2~60min ； 四、將步驟三中反應(yīng)完成的載體材料取出，用水清洗，干燥，即得到金屬納米島載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備金屬納米島載體的方法，其特征在于所述的步驟一中的金納米種子是通過化學(xué)還原法還原Au3+得到的，然后利用物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)相互作用結(jié)合到載體材料表面的；所述的步驟一中的載體材料表面吸附的金納米種子的粒徑為I~20nmo
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備金屬納米島載體的方法，其特征在于所述的步驟一中的載體材料為固相材料或懸浮材料；所述的固相材料為二維平面結(jié)構(gòu)；所述的固相材料可以為玻片、硅片、石英、聚偏二氟乙烯膜或硝酸纖維素膜；所述的懸浮材料可以為玻璃微珠、磁珠、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備金屬納米島載體的方法，其特征在于所述的金屬可以為銀、金-銀合金或銀/金核殼結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備金屬納米島載體的方法，其特征在于所述的步驟二中的還原劑為NaBH4, NH2OH, N2H4, CH2O或C6H12O6 ;所述的步驟二中的金屬離子溶液為Ag+溶液或Ag+與Au3+的混合溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的制備金屬納米島載體的方法，其特征在于所述的步驟二中的還原劑與含有的金屬離子的摩爾比為(0.7~1.5): I ;所述的步驟二中的金屬離子的溶液的濃度為0.3~5mM。
8.如權(quán)利要求1或2所述的金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，其特征在于:生物芯片中的捕獲分子捕獲相應(yīng)的物質(zhì)，進(jìn)行熒光掃描和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而完成免疫檢測，其中使用所述金屬納米島載體作為捕獲分子的修飾載體制成生物芯片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，其特征在于金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用包括:所述的金屬納米島載體表面修飾腫瘤標(biāo)志物抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用；所述的金屬納米島載體表面修飾自體免疫疾病相關(guān)的抗原、抗體分子制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在自體免疫疾病檢測中的應(yīng)用；所述的金屬納米島載體表面修飾乙肝抗體分子、流感病毒DNS序列、結(jié)合病抗體、瘧原蟲抗原(或抗體)、大腸桿菌抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在傳染性疾病的檢測中的應(yīng)用；所述的金屬納米島載體表面修飾白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子或生長因子的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞因子的檢測中的應(yīng)用；所述的金屬納米島載體表面修飾對不同疾病的單克隆抗體制備成生物芯片實(shí)現(xiàn)在對捕獲的目標(biāo)細(xì)胞分泌物進(jìn)行Elispot檢測中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中所述的金屬納米島載體在免疫檢測中的應(yīng)用，其特征在于所述的生物芯片為微陣列生物芯片或懸浮式生物芯片。
【文檔編號】G01N33/577GK103837676SQ201410106206
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】劉開, 袁超, 劉莊, 趙信博 申請人:蘇州納達(dá)生物科技有限公司