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一種水環(huán)境中十種雌激素的共檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)水環(huán)境中十種雌激素的技術(shù)。通過(guò)固相萃取技術(shù)對(duì)水樣進(jìn)行前處理后，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)其含量。本方法將采集后的水樣通過(guò)微孔濾膜除去水中懸浮的雜質(zhì)顆粒，并通過(guò)固相萃取裝置將水樣中的雌激素濃縮富集到固相萃取柱上，然后用乙酸乙酯將富集在固相萃取柱的雌激素洗脫下來(lái)，用氮?dú)獯蹈桑ㄈ?，最后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)雌激素的含量。該方法操作簡(jiǎn)便，回收率較高，耗時(shí)低，能同時(shí)檢測(cè)較多種類(lèi)的雌激素。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種水環(huán)境中十種雌激素的共檢測(cè)技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種運(yùn)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定水環(huán)境中雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A等十種雌激素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境雌激素是一種外源性物質(zhì)，能夠模擬和干擾人或動(dòng)物體內(nèi)雌激素的正常合成、運(yùn)輸、結(jié)合等過(guò)程，能對(duì)機(jī)體的生殖系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)造成影響。環(huán)境中存在的雌激素主要包括天然雌激素如雌酮(Estrone, El), 17 β -雌二醇(17 β-Estradiol, E2)和雌三醇(Estriol, E3)以及人工合成雌激素如乙炔雌二醇(17 a-Ethynylestradiol, EE2),壬基酌'(^1-n-Nonylphenol, NP),辛基酌.(4-tert_0ctylphenol, 0P),戍酸雌二醇(17-beta-Estradiol 17-valerate, EV),己烯雌酌'(Diethylstibestrol, DES),己燒雌酌.(Hexestrol, HEX),雙酹A (Bisphenol A)等,種類(lèi)豐富。人和動(dòng)物的每天都會(huì)排出天然雌激素，據(jù)報(bào)道，成年男性每天排出雌酮5 μ g，而女性每天排出的17 β-雌二醇和雌酮分別為2-12 μ g和3-20 μ g。人工合成雌激素如乙炔雌二醇被用作避孕藥被大量使用，當(dāng)被排入水體中也會(huì)對(duì)水體造成影響。研究表明，即使在極低的濃度，這些雌激素也會(huì)對(duì)水體中的魚(yú)類(lèi)等生物產(chǎn)生性別干擾，如雄魚(yú)雌性化，并會(huì)引起人類(lèi)的疾病。
[0003]近年來(lái)雌激素引起水體中魚(yú)類(lèi)雌性化的現(xiàn)象越來(lái)越引起人們的關(guān)注，而采用現(xiàn)代的檢測(cè)技術(shù)來(lái)對(duì)水體的痕量雌激素的檢測(cè)顯得尤為重要。檢測(cè)雌激素的方法有很多，但能同時(shí)檢出的雌激素種類(lèi)還較少 。主流檢測(cè)手段有氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)，特別是它們與質(zhì)譜聯(lián)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)與氣相色譜(GC/MS)相比，無(wú)需衍生化，耗時(shí)少。建立重現(xiàn)性好，回收率和靈敏度高，多種雌激素同時(shí)檢出的檢測(cè)方法十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是針對(duì)自然水體中的雌激素的含量，擬開(kāi)發(fā)一種回收率高，快速，準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A等十種雌激素的技術(shù)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種同時(shí)測(cè)量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A十種雌激素法定方法，該方法的步驟如下步驟:
(I)水樣前處理
將采集的水樣用0.45 ym孔徑的濾膜過(guò)濾并將pH值調(diào)至3.0。量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對(duì)水樣進(jìn)行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前進(jìn)行活化，條件為，先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預(yù)處理。待富集結(jié)束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質(zhì)，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標(biāo)化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮?dú)饬鲗⑵浯蹈?。將樣品轉(zhuǎn)移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測(cè)；
(2)使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)雌激素濃度
色譜柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒徑 2.6 μ m ;
流動(dòng)相及梯度洗脫條件:流動(dòng)相為0.5%的氨水(流動(dòng)相A)和純甲醇(流動(dòng)相B)，梯度洗脫條件為，流動(dòng)相B的比例在前2min內(nèi)保持在20%，2_8min內(nèi)從20%升到60%，8_13min內(nèi)從 60% 繼續(xù)增加到 90%, 13-16min 內(nèi)維持在 90%, 16-16.1min 從 90% 降至 20%, 16.l_20min內(nèi)維持在20%不變；
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，以外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(4)樣品含量的測(cè)定:
將采集的水樣按照1)的方法進(jìn)行前處理，按照2)所述的條件進(jìn)行雌激素的測(cè)定，并用3)中的方法計(jì)算雌激素的含量。
[0006]本發(fā)明所述的方法還包括采用Mill1-Q超純水，添加濃度為200 μ g/L，500 μ g/L的十種目標(biāo)混合標(biāo)樣，安裝(4)所述的含量測(cè)定方法，測(cè)定各雌激素的濃度。
[0007]本發(fā)明所述的雌激素為雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚Α。
[0008]本發(fā)明的有益效果是運(yùn)用固相萃取技術(shù)所需的有機(jī)溶劑較少，減少對(duì)環(huán)境的污染，并且富集倍數(shù)高，所用的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低，與氣相色譜相比更節(jié)約時(shí)間。本發(fā)明提供一種回收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高的共檢測(cè)方法，能同時(shí)測(cè)定較多種(十種)雌激素的含量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1 為 100 μ g/L 標(biāo)樣的譜圖，出峰順序?yàn)?EE2:10.06min, NP:14.58min, OP:13.07min, EV:14.20min, HEX: 10.53min, E3:6.46min, DES:9.79min, BPA:8.44min，El:9.92min, E2:9.90mino
圖2為100 μ g/L的NP的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為14.58min。
圖3為100 μ g/L的OP的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為13.07min。
圖4為100 μ g/L的EV的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為14.20min。
圖5為100 μ g/L的HEX的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為10.53min。
圖6為100 μ g/L的E3的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為6.46min。
圖7為100 μ g/L的DES的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為9.79min。
圖8為100 μ g/L的BPA的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為8.44min。
圖9為100 μ g/L的El的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為9.92min。
圖10為100 μ g/L的E2的標(biāo)樣的譜圖，出峰時(shí)間為9.90min。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述:
(I)水樣前處理
將采集的水樣用0.45 ym孔徑的濾膜過(guò)濾并將pH值調(diào)至3.0。量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對(duì)水樣進(jìn)行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前進(jìn)行活化，條件為先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預(yù)處理。待富集結(jié)束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質(zhì)，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標(biāo)化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮?dú)饬鲗⑵浯蹈伞悠忿D(zhuǎn)移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測(cè)；
(2)使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)雌激素濃度:
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的條件:液相為島津LC-20A，帶自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司，質(zhì)譜儀為AB的3200QTRAP線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀，帶電噴霧離子源(ESI)，美國(guó)Applied Biosystem公司；
色譜柱:Thermo Accucore C18, 100X 2.1mm,粒徑2.6 μ m。離子源:電噴霧離子源(ESI)，檢測(cè)模式:負(fù)離子檢測(cè)模式，離子噴霧電壓:-4500V，溫度:450°C，離子源氣體I壓力為35psi,離子源氣體2壓力為40psi,氣簾氣體(N2)壓力為12psi,碰撞氣(N2)壓力:High。流動(dòng)相采用純甲醇和0.5%氨水，梯度洗脫條件如表1 ;
通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀所測(cè)得的的雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A的定量限分別為0.4 μ g/L, 8 μ g/L,8 μ g/L, 8 μ g/L, 2 μ g/L, 4 μ g/L, 8 μ g/L, 0.8 μ g/L, 0.8 μ g/L 和 8 μ g/L ；
表1流動(dòng)相洗脫條件；
【權(quán)利要求】
1.一種水環(huán)境中同時(shí)測(cè)定十種雌激素的方法，包含以下十種:雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚Α。
2.該十種雌激素共檢測(cè)方法包含以下步驟: (1)水樣前處理 將采集的水樣用0.45 μ m孔徑的濾膜過(guò)濾并將pH調(diào)值至3.0，量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對(duì)水樣進(jìn)行富集,速度控制在10ml/min,固相萃取小柱使用前進(jìn)行活化，條件為先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預(yù)處理，待富集結(jié)束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質(zhì)，然后抽真空干燥20 min以去除水分，干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標(biāo)化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮?dú)饬鲗⑵浯蹈?，將樣品轉(zhuǎn)移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測(cè)； (2)使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)雌激素濃度:
色譜柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒徑 2.6 μ m ; 流動(dòng)相及梯度洗脫條件:流動(dòng)相為0.5%的氨水(流動(dòng)相A)和純甲醇(流動(dòng)相B)，梯度洗脫條件為，流動(dòng)相B的比例在前2min內(nèi)保持在20%，2_8min內(nèi)從20%升到60%，8_13min內(nèi)從 60% 繼續(xù)增加到 90%, 13-16min 內(nèi)維持在 90%, 16-16.1min 從 90% 降至 20%, 16.l_20min內(nèi)維持在20%不變 ； (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (4)樣品含量的測(cè)定 將采集的水樣按照I)的方法進(jìn)行前處理，按照2)所述的條件進(jìn)行雌激素的測(cè)定，并用3)中的方法計(jì)算雌激素的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103792314SQ201410031449
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】羅專(zhuān)溪, 王大鵬, 張嫻, 顏昌宙, 林立峰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所