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人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑及其制備和應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑及其制備和應(yīng)用方法，屬于帶有熒光標(biāo)記的免疫化學(xué)試劑。其是以泌尿系統(tǒng)感染的致病原菌株，制備單克隆抗體或多克隆抗體，然后將抗體與熒光納米量子點材料經(jīng)酰胺脫水縮合，連接為熒光納米量子點抗體復(fù)合物，可直接用于對載體材料上已包被了未知抗原如待測患者標(biāo)本樣品檢測，或預(yù)先包被在載體材料上對抗原檢測，這樣設(shè)計的本發(fā)明，具有對不同病原菌感染泌尿系統(tǒng)疾病檢測特異性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定；操作使用便捷，檢測快速、準(zhǔn)確、檢測時間短等特點。有效的指導(dǎo)臨床醫(yī)生準(zhǔn)確用藥，減少抗生素濫用，降低患者的診斷檢測及治療費用。從而產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【專利說明】人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑及其制備和應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及帶有熒光標(biāo)記的免疫化學(xué)試劑。具體是人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑及其制備和應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]泌尿系感染是由致病原，包括致病細(xì)菌、霉菌、真菌、病毒、病原蟲等，而以致病菌感染為主要感染源?？梢l(fā)腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎等病的總稱。近年來，隨著環(huán)境條件、免疫抑制劑使用、激素及介入技術(shù)等醫(yī)療手段的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致泌尿系感染的發(fā)病率日益上升，據(jù)報道，泌尿系感染發(fā)病率僅次于呼吸道感染。病原菌常由于患者免疫功能下降而侵入泌尿系統(tǒng)引起原發(fā)和繼發(fā)性尿路感染。其典型的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，尿頻、尿急、尿痛、排尿困難等膀胱刺激癥狀和恥骨上壓痛等，嚴(yán)重者可發(fā)生菌血癥和急、慢性腎功能不全甚至威脅患者生命。所以一旦病人發(fā)生了泌尿系感染，就有必要盡可能快速和準(zhǔn)確地確定該致病菌的種類、性質(zhì)和藥敏檢測結(jié)果，以便臨床醫(yī)師選擇最有效的治療方案進(jìn)行治療。
[0003]病原微生物檢測技術(shù)誕生已愈百年，但至今臨床上的主流檢測方法仍是基于細(xì)菌培養(yǎng)的菌種鑒定，這種傳統(tǒng)方法雖具有靈敏度好，準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，但是缺點也很明顯，就是存在方法步驟多，檢測所需時間長等問題。一般的大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果需要3天時間才能有明確的結(jié)果。但是臨床上有很多感染患者迫切者需要快速、明確其致病菌的種類，以便臨床醫(yī)師盡快地選用敏感的抗生素進(jìn)行對癥治療。尤其是那些因某些較為罕見的高耐藥性病原菌所引發(fā)的兇險感染，正是由于無法迅速的明確致病菌，從而導(dǎo)致醫(yī)師僅能使用一些廣譜的抗生素進(jìn)行治療，這種療效往往不盡如人意。所以，研制致病原快速、高效、準(zhǔn)確的檢測方法，具有廣泛的重要意義。
[0004]近些年以來，由于生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，各種各樣的檢測方法層出不窮。如基因探針檢測法，聚合酶鏈反應(yīng)法，電阻電導(dǎo)檢測法，微量熱法，免疫磁性微球法等一系列理化和免疫學(xué)方法。但是，在實際檢測中也還存在著不少問題使這些方法都未得到臨床的大規(guī)模應(yīng)用，主要問題有:操作復(fù)雜、對儀器要求高、測試時間相對較長、費用較高等等。因此，開發(fā)新型的快速、高效、準(zhǔn)確的檢測方法的意義就不言而喻了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，操作復(fù)雜、對儀器要求高、測試時間相對較長、費用較高等問題，而提供一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑及其制備和應(yīng)用方法。
[0006]一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑，其是以引發(fā)人泌尿系統(tǒng)感染的致病菌為抗原，制備單克隆抗體或多克隆抗體，該抗體與粒徑0.1- 1.0微米的熒光納米材料經(jīng)縮合連接連接為熒光納米量子點抗體復(fù)合物，直接用于對未知抗原的檢測，或包被在載體材料上，熒光納米量子點材料激發(fā)光波長為200nm - 700nm。
[0007]—種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其步驟為:
①.制備抗體
取人泌尿系統(tǒng)感染患者病樣標(biāo)本，分離病原菌抗原標(biāo)準(zhǔn)株，確定其菌屬性；
擴(kuò)大病原菌的培養(yǎng)，制備可溶性抗原；并以該抗原為致敏源，免疫動物，制備特異性多克隆抗體，或利用體外培養(yǎng)細(xì)胞融合技術(shù)制備特異性單克隆抗體；
②熒光納米材料和抗體的酰胺脫水縮合
a.將粒徑0.1- 1.0微米的熒光納米量子點材料Img溶于無離子水500ul內(nèi)，制成熒光納米量子點溶液；
b.另將1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺(EDC)與無離子水按lmg/lml濃度比的溶液200ul與上述熒光納米量子點溶液混合后，于4°C搖床反應(yīng)15-20分鐘，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與0.5mg NHS/Iml無離子水濃度比的溶液200ul反應(yīng)30分鐘；
c.然后按lmg/ml的濃度比加入純化后的上述抗體100-150ul反應(yīng),置于4°C搖床過夜，即得到酰胺脫水縮合后的熒光納米量子點抗體復(fù)合物溶液，直接用于對未知抗原的檢測，或包被于載體材料。
[0008]一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的應(yīng)用方法，
a.過濾包被:用2ml注射器吸取Iml待測尿液樣品，經(jīng)直徑Icm且內(nèi)置0.22微米濾膜的組裝式濾器過濾，取出濾膜，置載玻片上，風(fēng)干30分鐘，使菌體固定在膜片上；
b.在膜片上滴加200ul熒光納米量子點抗體復(fù)合物溶液，37°C，孵育Ih；
c.洗滌:每次用2mlPBS洗滌，洗3次，洗去未結(jié)合多余抗體；
d.觀察:將膜片置于熒光顯微鏡下，或熒光檢測儀，或激發(fā)不同波長的便攜式激發(fā)光源儀器，如紫外顯示器，以相關(guān)波長觀察熒光發(fā)光的留存結(jié)果。
[0009]這樣設(shè)計的本發(fā)明，具有對不同病原菌感染泌尿系統(tǒng)疾病檢測特異性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定；操作使用便捷，檢測快速、準(zhǔn)確、檢測時間短等特點。有效的指導(dǎo)臨床醫(yī)生準(zhǔn)確用藥，減少抗生素濫用，降低患者的診斷檢測及治療費用。從而產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是假生殖道棒桿菌菌株16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹不意圖；
圖2是臨床標(biāo)本假生殖道棒桿菌免疫熒光診斷檢測圖；
圖3是金黃葡萄球菌菌株16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖；
圖4是臨床標(biāo)本金黃葡萄球菌菌免疫熒光診斷檢測圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0012]實施例一:假生殖道棒桿菌免疫熒光診斷試劑的制備
I)菌株分離:為檢驗科經(jīng)泌尿系感染患者尿液中采集病原菌標(biāo)本。經(jīng)細(xì)菌血培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)24h獲得標(biāo)準(zhǔn)菌株。經(jīng)檢驗科細(xì)菌檢測儀檢測初步證實為致病菌株。(原初始檢測為大腸桿菌)2)菌株鑒定:形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)鑒定，主要測定項目包括:細(xì)胞形態(tài)，芽孢，革蘭氏染色，觸酶，運動性，M.R.，脲酶，丙二酸利用，碳源利用(木糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，海藻糖)，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣等。測定結(jié)果見表1:
表1假生殖道棒桿菌菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征
【權(quán)利要求】
1.一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑，其特征在于:以引發(fā)人泌尿系統(tǒng)感染的致病菌為抗原，制備單克隆抗體或多克隆抗體，該抗體與粒徑0.1- 1.0微米的熒光納米量子點材料經(jīng)縮合連接為熒光納米量子點抗體復(fù)合物，直接用于對未知抗原的檢測，或包被在載體材料上，熒光納米量子點材料激發(fā)光波長為200nm - 700nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑，其特征在于:所述的載體材料是高分子材料制備的微孔濾膜材，或片材，或棒材；或PVC材料制備的24孔板，或96孔板，或平皿，或反應(yīng)碟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑，其特征在于:所述高分子材料制備的微孔濾膜材孔徑0.22 - 0.45微米。
4.如權(quán)利要求1所述一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其特征在于: ①.制備抗體 取人泌尿系統(tǒng)感染患者病樣標(biāo)本，分離病原菌抗原標(biāo)準(zhǔn)株，確定其菌屬性； 擴(kuò)大病原菌的培養(yǎng)，制備可溶性抗原；并以該抗原為致敏源，免疫動物，制備特異性多克隆抗體，或利用體外培養(yǎng)細(xì)胞融合技術(shù)制備特異性單克隆抗體； ②熒光納米量子點材料和抗體的酰胺脫水縮合 a.將粒徑0.1- 1.0微米的熒光納米量子點材料Img溶于無離子水500ul內(nèi)，制成熒光納米量子點溶液； b.另將ImgEDC /Iml無離子水濃度的EDC溶液200ul與上述熒光納米量子點溶液混合后，于4°C搖床反應(yīng)15-20分鐘，再加入0.5mg NHS/Iml無離子水濃度的NHS溶液200ul反應(yīng)30分鐘； c.然后按lmg/ml的濃度加入純化后的上述①抗體100-150ul反應(yīng),置于4°C搖床過夜，即得到酰胺脫水縮合后的熒光納米量子點抗體復(fù)合物溶液，直接用于對未知抗原的檢測，或包被于載體材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其特征在于:熒光納米量子點材料是非金屬量子點熒光材料，或金屬量子點熒光材料，或貴金屬納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧?，熒光納米量子點的粒徑:0.1- 1.0微米。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其特征在于:熒光納米量子點材料的激發(fā)光波長為200nm - 700nm波長范圍內(nèi)的自發(fā)熒光物質(zhì)或人工合成的熒光物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其特征在于:熒光納米量子點材料的熒光發(fā)光色為藍(lán)色，或綠色，或橙色，或紅色。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的制備方法，其特征在于:所述的病原菌是細(xì)菌、真菌、霉菌中的任意一種。
9.一種人泌尿系統(tǒng)病原菌感染臨床診斷的免疫熒光診斷試劑的應(yīng)用方法，其特征在于: a.過濾包被:用2ml注射器吸取Iml待測尿液樣品，經(jīng)直徑Icm且內(nèi)置0.22微米濾膜的組裝式濾器過濾，取出濾膜，置載玻片上，風(fēng)干30分鐘，使菌體固定在膜片上； b.在膜片上滴加200ul熒光納米量子點抗體復(fù)合物溶液，37°C，孵育Ih；C.洗滌:每次用2ml PBS洗滌，洗3次，洗去未結(jié)合多余抗體；d.觀察:將膜片置于熒光顯微鏡下，或熒光檢測儀，或激發(fā)不同波長的便攜式激發(fā)光源儀器，如紫外顯示器，以相關(guān)波長觀察熒光發(fā)光的留存結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/577GK103499685SQ201310481151
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】牛遠(yuǎn)杰, 陳家童, 蔣寧, 尚芝群, 喻其林, 劉越 申請人:牛遠(yuǎn)杰, 陳家童, 蔣寧, 尚芝群, 喻其林, 劉越