毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的提取和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種對毛發(fā)中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的提取方法,包括毛發(fā)的提取和凈化步驟。該提取方法還可以包括一個(gè)衍生步驟。本發(fā)明還提供一種對毛發(fā)中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)進(jìn)行檢測的方法,采用了氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。與傳統(tǒng)的毛發(fā)毒品殘留檢測方法相比,本發(fā)明的方法更溫和,且有效地提取出了毛發(fā)中的藥物并有效地去除了毛發(fā)檢材中的多種雜質(zhì)干擾物,具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,可供政府執(zhí)法部門、檢驗(yàn)部門及藥檢機(jī)構(gòu)使用。
【專利說明】毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的提取和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測【技術(shù)領(lǐng)域】,特別是涉及毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的提取方法和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]毒品和濫用成癮性藥物危害人體健康和社會安全,一直是國家依法嚴(yán)厲打擊的對象,人體毒品殘留的檢測手段,對執(zhí)法的輔助作用至關(guān)重要。在對人體毒品殘留的檢測中,毛發(fā)檢材越來越受關(guān)注。相較于傳統(tǒng)的生物檢材(尿液、血液、唾液、組織等),毛發(fā)檢材具有無法比擬的獨(dú)特優(yōu)勢,例如:檢出時(shí)限長、藥物濫用信息全面、抗腐敗、易于采取、保存和重復(fù)取樣等。毛發(fā)檢測在藥物濫用鑒定中的作用也已被確證和公認(rèn)(KintzP.Analytical and practical aspects of drug testing in hair.Taylor&FrancisGroup, LLC, 2007:1-19 ;沈敏,向平.毛發(fā)分析基礎(chǔ)及應(yīng)用[Μ].北京:科學(xué)出版社.2010:3-34.)。
[0003]生物檢材成分復(fù)雜,存在大量的干擾物,毛發(fā)中存在許多內(nèi)源性雜質(zhì)。因此建立有效的前處理方法分離提取毛發(fā)中的目標(biāo)物是毛發(fā)檢測中的關(guān)鍵部分。毛發(fā)中氯胺酮及苯丙胺類毒品水解常用酸水解、堿水解、酶水解和甲醇提取等方法。酸水解法條件較為溫和,釋放效率較高,例如,在《氯胺酮濫用的毛發(fā)分析研究》中記載的一種酸水解方法,是將洗滌后的毛發(fā)樣本用0.lmol/L的HCl溶液ImL在45°C水浴中水解過夜,取出冷卻后調(diào)節(jié)PH至pH>10,用乙醚提取,取有機(jī)層吹干,得甲醇復(fù)溶殘留物,再注入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀加以分析(向平,沈敏,沈保華等.氯胺酮濫用的毛發(fā)分析研究.《法醫(yī)學(xué)雜志》2005 (21)4:290-293.)。但該方法依然存在酸水解時(shí)間太長,不滿足時(shí)效性的需求。堿水解藥物釋放完全,但條件激烈;酶水解適用范圍廣,釋放效率高,但價(jià)格昂貴。
[0004]目前,亟需一種對毛發(fā)中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)(包括苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮等)進(jìn)行高效分離提取的方法,以及進(jìn)行高靈敏度和高特異性檢測的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的提取方法,該方法非常溫和,但又能夠有效富集得到氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)。
[0006]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0007]—種毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(zhì)的提取方法,包括以下步驟:
[0008](I)清洗毛發(fā),以液氮研磨,得到毛發(fā)粉末;
[0009](2)加入復(fù)合毛發(fā)處理液并進(jìn)行超聲處理,并離心得到預(yù)處理上清液;所述復(fù)合毛發(fā)處理液是0.02-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,含0.5%_10%的牛血清蛋白、0.1%_5%的吐溫20,且 pH 值 2.0-5.0 ;[0010](3)固相萃取柱經(jīng)平衡后,注入所述毛發(fā)預(yù)處理上清液,依次用水、0.05-0.15M鹽酸溶液和甲醇洗滌雜質(zhì);用體積比為90:10-98:2的乙酸乙酯:氨水混合溶液洗脫氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(zhì),得到固相萃取洗脫液。
[0011]優(yōu)選地,步驟(2)所述復(fù)合毛發(fā)處理液0.025-0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,含
0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐溫20,且pH值2.0-4.0。
[0012]優(yōu)選地,步驟(2)所述的超聲處理為37_85°C進(jìn)行1.5-12小時(shí),更優(yōu)選地,為60-85°C進(jìn)行 2.0-4.0 小時(shí)。
[0013]優(yōu)選地,步驟(3)固相萃取柱依次經(jīng)甲醇、水和磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中,該方法還包括衍生步驟:將所述毛發(fā)的固相萃取洗脫液吹干,并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐(HFBA)混合溶液進(jìn)行衍生,再復(fù)溶于乙酸乙酯,得到衍生產(chǎn)物。
[0015]優(yōu)選地,所述衍生步驟為:55-75°C反應(yīng)20min-60min。
[0016]優(yōu)選地,所述衍生步驟為:將所述毛發(fā)的固相萃取洗脫液吹干,并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液,60-70°C反應(yīng)20min-30min,再復(fù)溶于乙酸乙酯,得到衍生產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明的另一目的還提供一種對毛發(fā)中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)進(jìn)行檢測的方法,該檢測方法靈敏度高,特異性好。
[0018]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0019]一種對毛發(fā)中的氯胺酮 、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)進(jìn)行檢測的方法,包括以下步驟:
[0020]I)根據(jù)上述提取方法得到所述固相萃取洗脫液或衍生產(chǎn)物;
[0021]2)采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述固相萃取洗脫液或衍生產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[0022]在其中一個(gè)實(shí)施例中,所述氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法的操作條件如下:
[0023]進(jìn)樣口溫度:150_280°C;
[0024]采用程序升溫模式,其中柱溫變化設(shè)定為:60- ( I分鐘)況Mi>180.C (2
分鐘)」-2001: ( I分鐘)240 cC (2分鐘)。
[0025]在其中一個(gè)實(shí)施例中,上述的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測的操作條件如下:
[0026]①色譜柱:Z0RBAXEclipse XDB-C182.1 X 150mm, 3.5 μ m,接 ZORBAX EclipseXDB-C182.1 X 12.5mm 保護(hù)柱;;
[0027]②柱溫:室溫;
[0028]③流動相:V(乙腈):V(乙酸銨緩沖溶液)=70:30 ;
[0029]④流速:250μ L/min ;
[0030]⑤進(jìn)樣量:IOyL ;
[0031]⑥質(zhì)譜條件:電噴霧電離離子源,正離子檢測模式;碰撞氣=Medium ;氣簾氣:25 ;離子噴霧電壓:5500V ;霧化氣溫度:5000C ;GS1:70 ;GS2:60。
[0032]本發(fā)明提供的一種對毛發(fā)中的毒品殘留進(jìn)行提取和檢測的方法,操作簡單,能有效檢測出藥物濫用人群毛發(fā)中的氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)等成分和含量,為臨床診斷提高科學(xué)依據(jù)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比,本發(fā)明的方法通過用復(fù)合毛發(fā)處理液對毛發(fā)進(jìn)行預(yù)處理和固相萃取,反應(yīng)條件非常溫和,且有效地去除了毛發(fā)檢材中的多種雜質(zhì)干擾物,高效分離提取了毛發(fā)中的目標(biāo)物。另外,再進(jìn)一步通過衍生步驟,更能有效富集到目標(biāo)物,提高了檢測靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是在陰性毛發(fā)基質(zhì)中添加氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按照實(shí)施例3中所述方法進(jìn)行提取凈化、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析所得的總離子流出色譜圖,圖中標(biāo)記分別為(A)苯丙胺及其內(nèi)標(biāo),(B)甲基苯丙胺及其內(nèi)標(biāo),(C)甲卡西酮及其內(nèi)標(biāo),(D)MDA及其內(nèi)標(biāo),(E)MDMA及其內(nèi)標(biāo),(F)MDEA及其內(nèi)標(biāo),(G)去甲氯胺酮及其內(nèi)標(biāo),(H) 4-甲基甲卡西酮及其內(nèi)標(biāo),(I)氯胺酮及其內(nèi)標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1
[0035]本實(shí)施例是陰性毛發(fā)中添加氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(zhì)(苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮),經(jīng)復(fù)合溶液預(yù)處理、固相萃取、衍生后進(jìn)行GC/MS-SIM分析。在同一天每個(gè)濃度配制6個(gè)樣本,測得各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值,計(jì)算回收率及CV值,確定方法回收率、日內(nèi)檢測的精密度;連續(xù)5天,分別配制這兩個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)添加樣本,測得各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值,計(jì)算CV值,確定方法的日間檢測精密度和準(zhǔn)確度。
[0036]一、實(shí)驗(yàn)步驟:
[0037](1)分別稱取約30mg的陰性毛發(fā),用3mL洗潔精、水、丙酮清洗后,剪成1.0mm片段,液氮碾磨,得到研磨后的毛發(fā)粉末;
[0038](2)分別精確稱取20mg研磨后的陰性毛發(fā)粉末,加入氯胺酮和苯丙胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),制得15000pg/mg、80000pg/mg兩個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品,加入2mL的毛發(fā)復(fù)合處理液(具體成分為0.025mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS),5%的牛血清蛋白,0.1%的吐溫20,且其PH值調(diào)節(jié)為2.0),加入內(nèi)標(biāo),在60°C下超聲4h,離心,獲得上清液;
[0039](3)依次用ImL甲醇、ImL水、ImL0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液平衡固相萃取柱,并注入上述毛發(fā)預(yù)處理上清液,用2mL水、Iml0.1M鹽酸溶液、3mL甲醇洗漆雜質(zhì),壓干5min,最后用乙酸乙酯:氨水(體積比90:10,總量為3mL)洗脫,得到洗脫液;
[0040](4)吹干洗脫液,將乙酸乙酯和七氟丁酸酐分別以40 μ L和10 μ L的體積比混合,在75°C的環(huán)境中衍生20min,冷卻,抽干,復(fù)溶于50 μ I的乙酸乙酯中,待氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析;
[0041](5)進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析,具體檢測條件如下:
[0042]①色譜柱:CD-5MS(30mX0.25mm X 0.25 μ m)色譜柱;
[0043]②進(jìn)樣口溫度:230 °C ;
[0044]③載氣:氮?dú)猓兌取?9.99%,流速為2.0mL/min ;
[0045]④采用不分流進(jìn)樣;[0046]⑤采用程序升溫模式,其中柱溫變化設(shè)定為:
【權(quán)利要求】
1.一種毛發(fā)中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(zhì)的提取方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)清洗毛發(fā),以液氮研磨,得到毛發(fā)粉末; (2)加入復(fù)合毛發(fā)處理液并進(jìn)行超聲處理,離心得到預(yù)處理上清液;所述復(fù)合毛發(fā)處理液是0.02-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%_5%的吐溫20,且pH 值為 2.0-5.0 ; (3)固相萃取柱經(jīng)平衡后,注入所述毛發(fā)預(yù)處理上清液,依次用水、0.05-0.15M鹽酸溶液和甲醇洗滌雜質(zhì);用體積比為90:10-98:2的乙酸乙酯:氨水混合溶液洗脫氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(zhì),得到萃取洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法,其特征在于, 所述復(fù)合毛發(fā)處理液是0.025-0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,含0.5%_5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐溫20,且pH值為2.0-4.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法,其特征在于, 步驟(2)所述的超聲處理為在37-85°C環(huán)境中進(jìn)行1.5-12小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法,其特征在于, 步驟(2)固相萃取柱依次經(jīng)甲醇、水和磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的提取方法,其特征在于,所述方法還包括有衍生步驟:將所述毛發(fā)的固相萃取洗脫液吹干,并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液進(jìn)行衍生,再復(fù)溶于乙酸乙酯,得到衍生產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法,其特征在于,所述衍生條件為:55-75°C反應(yīng)20min—60mino
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法,其特征在于,所述衍生步驟為: 將所述毛發(fā)的固相萃取洗脫液吹干,并用體積比4:1-:1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液,60-70°C反應(yīng)20min-30min,再復(fù)溶于乙酸乙酯,得到衍生產(chǎn)物。
8.—種對毛發(fā)中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(zhì)的檢測方法, 其特征在于,包括以下步驟: 1)根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述提取方法得到所述萃取洗脫液或根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述提取方法得到衍生產(chǎn)物; 2)采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述萃取洗脫液或衍生產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法,其特征在于,所述氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法的操作條件如下: 進(jìn)樣口溫度:150-280°C ; 采用程序升溫模式,其中柱溫變化設(shè)定為:60°C (I分鐘)25ciiiM 80 (2分鐘)^^2000C (I 分鐘)J^24(TC (2分鐘)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法,其特征在于,所述液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法的操作條件如下: ①色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C182.1 X 150mm, 3.5 μ m,接 ZORBAX EclipseXDB-C182.1 X 12.5mm 保護(hù)柱;; ②柱溫:室溫; ③流動相:乙腈:乙酸銨緩沖溶液=70:30(V:V); ④流速:250μL/min ; ⑤進(jìn)樣量=IOyL; ⑥質(zhì)譜條件:電噴霧電離離子源,正離子檢測模式;碰撞氣=Medium;氣簾氣:25 ;離子噴霧電壓:5500V ;霧化氣溫度 :5000C ;GS1:70 ;GS2:60。
【文檔編號】G01N30/06GK103575831SQ201310439888
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】陳園園, 劉曉云, 王繼華 申請人:廣州正孚檢測技術(shù)有限公司