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用于骨髓活檢的固定-脫鈣液及骨髓活檢組織石蠟切片方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于骨髓活檢的固定-脫鈣液及骨髓活檢組織石蠟切片方法。所述固定-脫鈣液包括40%的甲醛、EDTA和緩沖液，pH值為7.0-7.2。本發(fā)明所述的試劑和方法將骨髓組織的固定和脫鈣這兩個(gè)步驟合并在一起同時(shí)完成，中途無需換液，減少了操作環(huán)節(jié)，縮短了標(biāo)本前處理過程，更有利于醫(yī)生得出診斷結(jié)論，給出治療方案。所得到的HE切片顯示細(xì)胞形態(tài)保存完好，組織結(jié)構(gòu)清楚；免疫組織化學(xué)染色顯示染色效果優(yōu)良，定位準(zhǔn)確，背景干凈；樣本沒有出現(xiàn)脫鈣過度的現(xiàn)象。
【專利說明】用于骨髓活檢的固定-脫鈣液及骨髓活檢組織石蠟切片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于骨髓活檢的固定-脫鈣液及骨髓活檢組織石蠟切片方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨髓活體組織檢查術(shù)簡稱骨髓活檢，就是用一個(gè)特制的穿刺針取一小塊大約1.0-2.0厘米長的圓柱形骨髓組織來作病理學(xué)檢查。操作方法與骨髓涂片穿刺術(shù)完全相同，骨髓活檢保持了完整的骨髓組織結(jié)構(gòu)，能很好地反映骨髓增生程度，比較全面地了解骨髓病態(tài)特點(diǎn)，尤其是髓外腫瘤的骨髓浸潤。
[0003]現(xiàn)在常采用石蠟切片技術(shù)制作骨髓活檢組織，主要包括以下步驟:骨髓樣本組織的固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染色及按疾病診斷需要進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。影響骨髓石蠟切片的質(zhì)量是多方面的，其中骨髓組織的固定、脫鈣、染色等關(guān)鍵環(huán)節(jié)處理不當(dāng)，均可影響切片的質(zhì)量，從而影響醫(yī)生對病理學(xué)診斷結(jié)果地判斷。
[0004]制作高質(zhì)量的骨髓切片最重要的環(huán)節(jié)是標(biāo)本組織的固定和脫鈣。如果骨髓標(biāo)本組織未被充分固定，那么在后續(xù)的環(huán)節(jié)中標(biāo)本組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)各種成分就會被破壞。如果標(biāo)本組織脫鈣不完全，將無法切出完整的石蠟切片，且在染色過程中容易掉片，容易人為地造成組織結(jié)構(gòu)不完整。
[0005]現(xiàn)在常用的骨髓標(biāo)本固定液有10%的中性福爾馬林、Bouin液或LowyFMA液。常用的脫鈣液有無機(jī)酸或EDTA等溫和脫鈣液。使用10%的中性福爾馬林固定的時(shí)間為16-24小時(shí)，因?yàn)槿绻潭〞r(shí)間太短，可能導(dǎo)致不均勻的免疫反應(yīng)，陳舊組織較容易產(chǎn)生色素沉淀。Bouin液包含具有強(qiáng)烈刺激性氣味的冰醋酸，檢驗(yàn)員在使用這類固定液時(shí)，呼吸系統(tǒng)會受到強(qiáng)烈地刺激。LowyFMA液中包含屬于易爆試劑的苦味酸，操作時(shí)要非常小心，使用這類固定液存在一定的安全隱患。使用Bouin液和LowyFMA液固定標(biāo)本組織，作用時(shí)間也需16-24小時(shí)。
[0006]現(xiàn)在常用的脫鈣液有兩類:一種是無機(jī)酸，這類脫鈣液的脫鈣速度較快，一般骨髓活檢組織脫鈣2小時(shí)即可，但可能會導(dǎo)致許多抗原的丟失，對免疫組織化學(xué)染色有明顯影響。另一種為溫和脫鈣液，如EDTA等，但脫鈣速度慢，需要過夜。
[0007]在現(xiàn)有的骨髓活檢石蠟切片方法中樣本組織的固定和脫鈣環(huán)節(jié)是分開兩個(gè)步驟進(jìn)行的，即先用固定液對骨髓標(biāo)本固定，然后固定液更換成脫鈣液完成樣本脫鈣。用固定液在室溫條件下完成樣本的固定需要16-24小時(shí)，用脫鈣液完成樣本的脫鈣需要18-24小時(shí)。這樣一來，整個(gè)固定和脫鈣大約需要花費(fèi)24-48小時(shí)。而這樣長時(shí)間的骨髓樣本切片制作過程，直接導(dǎo)致給出檢測診斷結(jié)果的時(shí)間增加，影響治療的及時(shí)性。再者，現(xiàn)有的切片方法中固定和脫鈣是分開的兩個(gè)步驟，且每個(gè)步驟都需要嚴(yán)格控制時(shí)間，一旦固定或脫鈣的處理時(shí)間不準(zhǔn)確就會直接影響到后續(xù)石蠟切片的效果，因此檢驗(yàn)員必須在檢驗(yàn)過程中騰出時(shí)間去更換工作液(從固定液更換為脫鈣液)，這樣的工作量是很大的。
[0008]另一方面，為了促進(jìn)健康服務(wù)業(yè)務(wù)，將人員、配備要求較高的檢驗(yàn)業(yè)務(wù)項(xiàng)目交給第三方獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成為趨勢。這樣將分散在各大醫(yī)院的樣本集中到獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成各種檢驗(yàn)項(xiàng)目。醫(yī)院收集病人的樣本并轉(zhuǎn)送到第三方獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)送時(shí)間少則I天，多則2-3天?，F(xiàn)有的骨髓活檢方法需要中途更換工作液，因此現(xiàn)有方法就不太適合采用第三方獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室來完成骨髓活檢項(xiàng)目。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種用于骨髓活檢的樣本固定-脫鈣液，包括40%的甲醛、EDTA和緩沖液，pH值為7.0-7.2。
[0010]進(jìn)一步地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
[0011]進(jìn)一步地，以1000ml計(jì),包括:
0.1M磷酸鹽緩沖液 900ml ；
40%的甲醛100ml;
EDTA150 克；
pH 值為 7.0-7.2。
[0012]本發(fā)明還提供一種骨髓活檢組織石蠟切片的方法，包括以下步驟:骨髓樣本用固定-脫鈣液進(jìn)行固 定和脫鈣、流水沖洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色和/或免疫組織化學(xué)染色，其特征在于，所述的固定-脫鈣液包括40%的甲醛、EDTA和緩沖液，pH值為
7.0-7.2。
[0013]進(jìn)一步地，以1000ml計(jì),包括:
0.1M磷酸鹽緩沖液 900ml ；
40%的甲醛100ml;
EDTA150 克；
pH 值為 7.0-7.2。
[0014]進(jìn)一步地，樣本:固定-脫鈣液的體積比等于或大于1:10。
[0015]進(jìn)一步地，固定-脫鈣的時(shí)間為20-72小時(shí)。
[0016]進(jìn)一步地，HE染色的方法包括:脫蠟、染色，脫水、透明和封固。
[0017]進(jìn)一步地，染色步驟包括依次放入蘇木素染料6分鐘，水洗I分鐘，0.5-1%鹽酸酒精分化片刻，使得顏色由藍(lán)變紅即可，自來水沖洗約10分鐘，顏色由紅變藍(lán)即可，伊紅染液浸染。
[0018]進(jìn)一步地，自來水沖洗10分鐘顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色后，在用95%酒精處理。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明所述的固定-脫鈣液和骨髓活檢組織石蠟切片，能將骨髓組織的固定和脫鈣的兩個(gè)步驟合并在一起同時(shí)完成，在骨髓活檢組織石蠟切片過程中就不需要中途換液，減少了操作環(huán)節(jié)。相比于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明所述試劑和方法可以至少提前I天完成石蠟切片，縮短了標(biāo)本前處理過程，更有利于醫(yī)生得出診斷結(jié)論，給出治療方案。采用本發(fā)明所述的試劑和方法所得到的HE切片顯示細(xì)胞形態(tài)保存完好，組織結(jié)構(gòu)清楚；免疫組織化學(xué)染色顯示染色效果優(yōu)良，定位準(zhǔn)確，背景干凈；即使將樣本長時(shí)間的浸泡在固定-脫鈣液中，例如經(jīng)72小時(shí)，樣本依然沒有出現(xiàn)脫鈣過度的現(xiàn)象，HE切片和免疫組織化學(xué)染色均未受影響?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1是病例I骨髓活檢HE染色，顯示骨髓增生活躍，體積偏小的細(xì)胞增生，但難以準(zhǔn)確鑒別其增生的細(xì)胞來源。
[0021]圖2是病例I⑶3免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的T淋巴細(xì)胞。
[0022]圖3是病例I⑶20免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的B淋巴細(xì)胞。
[0023]圖4是病例I⑶79a免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的B淋巴細(xì)胞。
[0024]圖5是病例I⑶235a免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的紅系前體細(xì)胞。
[0025]圖6是病例I Lysozyme免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
[0026]圖7是病例I MPO免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
[0027]圖8是病例I PAX5免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的B淋巴細(xì)胞。
[0028]圖9是病例2骨髓活檢HE染色，顯示骨髓增生低下，分化成熟的細(xì)胞偏少，但不能準(zhǔn)確識別其中的原始細(xì)胞并評估其比例。
[0029]圖10是病例2骨髓活檢HE染色，顯示骨髓增生低下，分化成熟的細(xì)胞偏少，但不能準(zhǔn)確識別其中的原始細(xì)胞并評估其比例。
[0030]圖11是病例2⑶34免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓組織中的原始細(xì)胞及其分布情況。
[0031]圖12是病例3骨髓活檢HE染色，顯示骨髓中細(xì)胞增生程度正常，漿細(xì)胞比例增高，但不能準(zhǔn)確評估其中的漿細(xì)胞比例、并判斷其是否為單克隆增生。
[0032]圖13是病例3⑶138免疫組織化學(xué)染色，顯示骨髓中漿細(xì)胞增生及分布情況。
[0033]圖14是病例3 Kappa染色，顯示漿細(xì)胞克隆性增生情況。
[0034]圖15是病例3 Lambda染色，顯示漿細(xì)胞克隆性增生情況。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0036]實(shí)施例1骨髓活檢組織固定-脫鈣液的配制 以IOOOml計(jì)，包括
0.1M磷酸鹽緩沖液(PBS) 900ml ；
40%的甲醛100ml;
EDTA150 克；
調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2。
[0037]其中，緩沖液除PBS夕卜，還可選擇其他適合的緩沖液。
[0038]實(shí)施例2骨髓活檢組織固定-脫鈣的方法
骨髓活檢標(biāo)本用實(shí)施例1中所述的固定-脫鈣液進(jìn)行固定和脫鈣，其中樣本:固定-脫鈣液的體積比等于或大于1:10。常溫固定-脫鈣20-72小時(shí)，之后用流水沖洗。本發(fā)明骨髓組織的固定和脫鈣是在固定-脫鈣液中同時(shí)完成的。
[0039]實(shí)施例3骨髓活檢組織石蠟切片的方法
骨髓活檢的標(biāo)本用實(shí)施例1、例2中所述的固定-脫鈣液及方法進(jìn)行固定和脫鈣20-72小時(shí)、流水沖洗、脫水、浸蠟、包埋、切片(切片厚度2-3 μ Μ)、HE染色和/或免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察。所得切片可直接用于顯微鏡觀察、病理學(xué)檢查，也可根據(jù)不同的需要進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。所得HE切片組織細(xì)胞保存完好，染色效果佳。免疫組織化學(xué)染色陽性定位準(zhǔn)確，背景著色淺。
[0040]其中脫水的方法包括:將完成了固定脫鈣處理的骨髓組織依次放入甲醛60分鐘，水10分鐘，75%乙醇60分鐘，85%乙醇60分鐘，95%乙醇60分鐘，95%乙醇90分鐘，100%乙醇60分鐘，100%乙醇90分鐘，二甲苯30分鐘，二甲苯40分鐘。
[0041]其中石蠟包埋的方法包括:將完成脫水處理的骨髓組織依次放入石蠟60分鐘，石蠟90分鐘，石蠟90分鐘。
[0042]其中HE染色的方法包括:將完成石蠟包埋后，切片，并依次完成脫蠟，染色，脫水，透明，封固。
[0043]其中脫蠟的步驟包括:依次放入二甲苯5分鐘，兩次，100%酒精I(xiàn)分鐘，100%酒精I(xiàn)分鐘，95%酒精I(xiàn)分鐘，80%酒精I(xiàn)分鐘，自來水沖洗I分鐘。
[0044]其中染色的步驟包括:依次放入蘇木素染料6分鐘，水洗I分鐘，0.5-1%鹽酸酒精分化片刻，使得顏色由藍(lán)變紅即可，自來水沖洗約10分鐘,顏色由紅變藍(lán)即可,伊紅染液浸染。在優(yōu)選的方案中，自來水沖洗10分鐘顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色后，用95%酒精處理片刻，以避免所帶的水份稀釋了伊紅染液，影響染色效果。
[0045]其中脫水透明封固的步驟包括:依次放入75%酒精0.5分鐘，85%酒精I(xiàn) I分鐘，95%酒精I(xiàn)I I分鐘，100%酒精I(xiàn) I分鐘，100%酒精I(xiàn)I I分鐘，石炭酸:二甲苯為1:3溶液10秒鐘，二甲苯I透明I分鐘，二甲苯II透明I分鐘，取出后用中性樹膠封固。
[0046]實(shí)施例4利用本發(fā)明對臨床樣本進(jìn)行骨髓活檢
取3個(gè)病例原始骨髓樣本，均利用本發(fā)明所述的固定-脫鈣液和方法，所加固定-脫鈣液分別為10ml、15ml、15ml，處理時(shí)間分別為20小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。采用實(shí)施例1-3的試劑和方法完成樣本的固定、脫鈣、脫水、浸蠟、石蠟包埋、HE切片和/或免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡觀察結(jié)果見圖1-15。
[0047]病例1:HE切片中示骨髓中灶狀分布的體積偏小的細(xì)胞巢，根據(jù)HE切片不能分別出淋巴細(xì)胞、紅系前體細(xì)胞或是體積偏小的原始細(xì)胞，經(jīng)等免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，耙細(xì)胞定位準(zhǔn)確，背景干凈，幫助診斷醫(yī)生準(zhǔn)確識別細(xì)胞來源。圖1是病例I的HE染色結(jié)果，圖 2-8 分別是病例 I 的 CD3、CD20、CD79a、CD235a、Lysozyme、MPO, PAX5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。用本發(fā)明方法對病例I完成的骨髓活檢診斷結(jié)果與用其他方法完成的診斷結(jié)果一致。
[0048]病例2:HE切片示骨髓中細(xì)胞量較正常人偏少，可見一些體積偏小的細(xì)胞，HE切片中難以識別其原始細(xì)胞比例，經(jīng)⑶34免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，幫助診斷醫(yī)生準(zhǔn)確識別原始細(xì)胞比例和分布特點(diǎn)。圖9和10是HE染色結(jié)果，圖11是CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。用本發(fā)明方法對病例2完成的骨髓活檢診斷結(jié)果與用其他方法完成的診斷結(jié)果—致。
[0049]病例3:HE切片示骨髓中細(xì)胞量大致正常，可見漿細(xì)胞和漿樣細(xì)胞比例增高，但HE切片中不能判斷其漿細(xì)胞是否為單克隆性增生，經(jīng)⑶138、Kappa、Lambda免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，可準(zhǔn)確識別漿細(xì)胞的比例及分布情況，并判斷其是否為Kappa或Lambda單克隆增生。圖12是HE染色，圖13是⑶138免疫組織化學(xué)染色，圖14是Kappa免疫組織化學(xué)染色，圖15是Lambda免疫組織化學(xué)染色。用本發(fā)明方法對病例3完成的骨髓活檢診斷結(jié)果與用其他方法完成的診斷結(jié)果一致。
[0050]從上述病例的檢測可以看出利用本發(fā)明的試劑和方法處理樣本，縮短了前期處理時(shí)間，經(jīng)石蠟切片、HE及免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察:1、HE切片顯示細(xì)胞形態(tài)保存完好，組織結(jié)構(gòu)清楚。2、免疫組織化學(xué)染色顯示染色效果優(yōu)良，陽性定位準(zhǔn)確，背景干凈，為病理診斷提供的依據(jù)。另一方面，在處理原始標(biāo)本時(shí)不需換液，并且可縮短固定-脫鈣處理時(shí)間約24小時(shí)。經(jīng)本發(fā)明方法處理的標(biāo)本與用現(xiàn)有常規(guī)的方法得到的標(biāo)本比較，本發(fā)明完全能夠達(dá)到現(xiàn)有常規(guī)方法的效果，能夠滿足臨床檢驗(yàn)診斷的要求，而檢測所用時(shí)間相比現(xiàn)有常規(guī)方法大大縮短，操作步驟簡單。并且利用本發(fā)明的方法經(jīng)72小時(shí)處理的樣本沒有出現(xiàn)脫鈣過度的現(xiàn)象，HE切片和免疫組織化學(xué)染色均未受影響，能滿足需要較長時(shí)間運(yùn)輸、存放樣本的要求。而將現(xiàn)有常規(guī)方法經(jīng)48小時(shí)脫鈣處理的樣本作為對照，結(jié)果顯示用現(xiàn)有常規(guī)方法脫鈣處理48小時(shí)后會出現(xiàn)脫鈣過度的現(xiàn)象，影響制片結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種用于骨髓活檢的樣本固定-脫鈣液，包括40%的甲醛、EDTA和緩沖液，pH值為7.0-7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定-脫鈣液，其特征在于，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定-脫鈣液，其特征在于，以1000ml計(jì)，包括: 0.1M磷酸鹽緩沖液 900ml ； 40%的甲醛100ml; EDTA150 克；
pH 值為 7.0-7.2。
4.一種骨髓活檢組織石蠟切片的方法，包括以下步驟:骨髓樣本用固定-脫鈣液進(jìn)行固定和脫鈣、流水沖洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色和/或免疫組織化學(xué)染色，其特征在于，所述的固定-脫鈣液包括40%的甲醛、EDTA和緩沖液，pH值為7.0-7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，以1000ml計(jì)，包括: 0.1M磷酸鹽緩沖液 900ml ； 40%的甲醛100ml; EDTA150 克；
pH 值為 7.0-7.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，樣本:固定-脫鈣液的體積比等于或大于I:10o
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，固定-脫鈣的時(shí)間為20-72小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，HE染色的方法包括:脫蠟、染色，脫水、透明和封固。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，染色步驟包括依次放入蘇木素染料6分鐘，水洗I分鐘，0.5-1%鹽酸酒精分化片刻，使得顏色由藍(lán)變紅即可，自來水沖洗約10分鐘，顏色由紅變藍(lán)即可，伊紅染液浸染。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，自來水沖洗10分鐘顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色后，在用95%酒精處理。
【文檔編號】G01N1/36GK103994913SQ201410065474
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】夏成青, 陳紅梅 申請人:武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司