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用于檢測核小體加合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測和測量核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法以及此類測量用于疾病檢測和診斷的用途。本發(fā)明還涉及鑒定核小體加合物生物標志用于疾病檢測和診斷的方法和由所述方法鑒定的生物標志。
【專利說明】用于檢測核小體加合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測和測量核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法以及此類測量 用于疾病檢測和診斷的用途。本發(fā)明還涉及鑒定核小體加合物生物標志用于疾病檢測和診 斷的方法和由所述方法鑒定的生物標志。
[0002] 發(fā)明背景 人體包含幾百種細胞類型。所有這些細胞類型均含有相同基因組，但廣泛不同的表 型和在體內(nèi)不同的功能。該表型多樣性是由于基因組在不同細胞類型中的差異表達。差 異基因表達的控制并未完全了解，但基本機制包括由與基因相關(guān)的許多互聯(lián)表觀遺傳信號 (印igenetic signals)的基因調(diào)節(jié)，包括染色質(zhì)包裝為常染色質(zhì)或異染色質(zhì)的控制、核小 體定位和核酸酶可接近位點的控制、DNA的甲基化和DNA在其周圍纏繞的核小體結(jié)構(gòu)中的 變化。
[0003] 核小體是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位并且由八個高度保守的核心組蛋白的蛋白質(zhì)復(fù) 合物組成(包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各一對)。在該復(fù)合物周圍纏繞約146個堿基對的 DNA。另一種組蛋白H1或H5充當接頭，并且涉及染色質(zhì)壓實。DNA在通常被說成類似"串 上的珠"的結(jié)構(gòu)中繞在連續(xù)核小體周圍，并且這構(gòu)成開放的或常染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)。在壓 實的或異染色質(zhì)中，該串是卷曲的并且超卷曲成閉合和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（Herranz和Esteller, 2007)。
[0004] 在成年人中的正常的細胞更新涉及每天通過約1011細胞的細胞分裂的產(chǎn)生和主 要通過細胞凋亡的相似數(shù)目的死亡。在細胞凋亡的過程期間，染色質(zhì)分解成由細胞釋放的 單核小體和寡核小體。在正常條件下，這些被去除并且在健康個體中發(fā)現(xiàn)的循環(huán)核小體水 平很低。升高水平在具有多種狀況的個體中發(fā)現(xiàn)，所述狀況包括多種癌癥、自身免疫疾病、 炎性狀況、中風(fēng)和心肌梗塞（Holdenrieder和Stieber，2009)。
[0005] 單核小體和寡核小體可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)進行檢測，并且?guī)追N方 法已得到報道（Salgame 等人，1997 ;Holdenrieder 等人，2001 ;van Nieuwenhuijze 等人， 2003)。這些測定通常采用抗組蛋白抗體(例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4)作 為捕獲抗體和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA復(fù)合抗體作為檢測抗體。然而，我們已發(fā)現(xiàn)這些測 定的結(jié)果彼此不一致。此外，盡管血清或血漿中的大多數(shù)循環(huán)DNA據(jù)報道作為單核小體和 寡核小體存在（Holdenrieder等人，2001 )，但測量的血清或血漿中的核小體和DNA水平并 不良好吻合。循環(huán)細胞游離核小體（circulating cell free nucleosomes)水平的ELISA結(jié) 果和如通過實時PCR (聚合酶鏈反應(yīng)）測量的循環(huán)DNA水平之間的相關(guān)系數(shù)據(jù)報道在血清 中是 r=0. 531，并且在血楽中是 r=0. 350 (Holdenrieder 等人，2005)。
[0006] 核小體ELISA方法用于細胞培養(yǎng)中，主要作為檢測細胞凋亡的方法（Salgame等 人，1997 ;Holdenrieder 等人，2001 ; van Nieuwenhuijze 等人，2003)，以及還用于測量血 清和血漿中的循環(huán)細胞游離核小體（Holdenrieder等人，2001)。由瀕死細胞釋放到循環(huán) 內(nèi)的細胞游離血清和血漿核小體水平已通過ELISA方法在眾多不同癌癥的研究中進行測 量，以評估其作為潛在生物標志的用途（Holdenrieder等人，2001)。平均循環(huán)核小體水平 據(jù)報道在研究的大多數(shù)但并非全部癌癥中很高。最高的循環(huán)核小體水平在肺癌個體中觀 察到。最低水平在前列腺癌中觀察到，其在健康個體的正常范圍內(nèi)。然而，具有惡性腫瘤 的個體據(jù)報道具有相當不同的血清核小體濃度，并且發(fā)現(xiàn)具有晚期腫瘤疾病的一些個體具 有低循環(huán)核小體水平，在對于健康個體測量的范圍內(nèi)（Holdenrieder等人，2001)。由于這 點和核小體水平升高的多種非癌癥原因，循環(huán)核小體水平未在臨床上用作癌癥的生物標志 (Holdenrieder 和 Stieber，2009)。
[0007] 核小體的結(jié)構(gòu)可以通過組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM)和通過包括變體組蛋白而改 變。組蛋白的PTM通常在八核組蛋白的尾部上發(fā)生，并且常見修飾包括賴氨酸殘基的乙酰 化、甲基化或泛素化以及精氨酸殘基的甲基化和絲氨酸殘基的磷酸化。組蛋白修飾已知涉 及基因表達的表觀遺傳調(diào)節(jié)（Herranz和Esteller，2007)。核小體的結(jié)構(gòu)還可以通過包 括可選組蛋白同種型或變體而改變，所述可選組蛋白同種型或變體是不同基因或剪接產(chǎn) 物，并且具有不同的氨基酸序列。組蛋白變體可以分類成多個家族，所述家族再分成各個 類型。大量組蛋白變體的核苷酸序列是已知的，并且例如在下述中可公開獲得：National Human Genome Research Institute NHGRI Histone DataBase(Marin〇-Ramirez,L. ,Levine, K. M. , Morales, M. , Zhang, S. , Moreland, R. T. , Baxevanis, A. D.和 Landsman, D. The Histone Database ：an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol. 2011.(已投稿）和 http://genome. nhgri. nih. gov/histones/ complete. shtml)、GenBank(NIH 遺傳序列）DataBase、EMBL Nucleotide Sequence Database 和 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)。
[0008] 健康和患病細胞中存在的組蛋白變體和組蛋白修飾模式在眾多（主要是免疫組織 化學(xué)）研究中已顯示是不同的（Herranz和Esteller，2007)。臨床使用的免疫組織化學(xué)方 法的一個缺點是組織樣品收集涉及侵入性手術(shù)或活組織檢查。
[0009] 除由核小體結(jié)構(gòu)和位置介導(dǎo)的表觀遺傳信號傳導(dǎo)之外，細胞中的基因表達控制也 由DNA的甲基化狀態(tài)介導(dǎo)（Herranz和Esteller，2007)。一段時間以來本領(lǐng)域已知DNA可 以在胞嘧啶核苷酸的第5位處甲基化，以形成5-甲基胞嘧啶。
[0010] DNA甲基化在癌癥中的涉及早在1983年得到報道（Feinberg和Vogelstein, 1983)。在癌細胞中觀察到的DNA甲基化模式不同于健康細胞的那些。特別在近著絲粒區(qū) 域周圍的重復(fù)元件據(jù)報道相對于健康細胞在癌癥中是低甲基化的，但特定基因的啟動子據(jù) 報道在癌癥中是高甲基化的。這兩種效應(yīng)的平衡據(jù)報道導(dǎo)致癌細胞中的總體DNA低甲基化 (Rodriguez-Paredes 和 Esteller，2011)。
[0011] 某些特定基因的高甲基化可以用作癌癥的診斷生物標志。例如，報道通過從血漿 提取的DNA的PCR擴增用于檢測S印tin 9基因的高甲基化的方法據(jù)報道檢測72%的結(jié)腸 癌，伴隨10%的假陽性率（Grutzmann等人，2008)。特定基因或基因座的DNA甲基化狀態(tài) 通常通過胞啼陡而不是5-甲基胞啼陡至尿啼陡的選擇性亞硫酸氫鹽脫氨基（bisulphite deamination)進行檢測，導(dǎo)致可以通過測序或其他方法檢測的一級DNA序列改變（A1 len等 人，2004)。
[0012] 總體DNA低甲基化是癌細胞的標志（Esteller 2007和Hervouet等人，2010)?？?體DNA甲基化可以使用免疫組織化學(xué)技術(shù)在細胞中進行研究。或者，從細胞中提取DNA用 于分析。
[0013] 多年來已知除核酸和組蛋白蛋白質(zhì)之外，染色質(zhì)包含與其組成成分DNA和/或組 蛋白結(jié)合的大量非組蛋白蛋白質(zhì)（Yoshida和Shimura, 1972)。這些染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)具有 廣泛多樣的類型，并且具有多種功能，包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄增強因子、轉(zhuǎn)錄阻遏因子、組蛋白 修飾酶、DNA損害修復(fù)蛋白質(zhì)及許多其他功能。染色質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)的研究已在很大程度上 通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP)法進行。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的，但卻是復(fù)雜、費力和 昂貴的。
[0014] 在典型Chip法中，細胞染色質(zhì)是交聯(lián)的，使得所有蛋白質(zhì)和核酸組分彼此共價附 著。隨后剪切染色質(zhì)以形成單核小體和寡核小體的制劑。將針對目的蛋白質(zhì)的抗體加入剪 切的染色質(zhì)，以免疫沉淀含有蛋白質(zhì)的那些染色質(zhì)片段?？贵w通常附著至固相(例如塑料 珠)，以促進含有目的蛋白質(zhì)的染色質(zhì)復(fù)合物的分離。隨后逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，并且通過用蛋白酶消 化去除蛋白質(zhì)。將與染色質(zhì)復(fù)合物相關(guān)的DNA分離且分析，以測定與特定蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān) 的DNA序列、基因或基因座，其使用多種技術(shù)中的任一種，包括PCR隨后凝膠電泳、DNA測序 (ChlP-Seq)或 DNA 微陣列（ChIP-〇n_chip)。
[0015] 這些Chip法揭示與染色質(zhì)結(jié)合組蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的DNA序列。Chip法的衍生方 法已得到開發(fā)，以促進非組蛋白蛋白質(zhì)與組蛋白和核小體的關(guān)系的研究，包括例如組蛋白 相關(guān)測定（Rieke 和 Bielinsky，2005)。
[0016] 與染色質(zhì)結(jié)合的許多蛋白質(zhì)涉及癌癥及其他疾病機制，但其在循環(huán)中以核小體加 合物形式的豐度先前未進行研究。實例包括高速泳動族盒蛋白（High Mobility Group Box Protein) 1 (HMGB1)、多梳蛋白（polycomb protein) Zeste 同源物 2 的增強子（EZH2)和核 受體族的蛋白質(zhì)。
[0017] 高速泳動族蛋白是以約3%的DNA或組蛋白重量存在的染色質(zhì)組分。它們是與核小 體結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，對潛在DNA序列沒有任何已知特異性（Gerlitz等人；2009)。HMGB1 是構(gòu)筑染色體蛋白質(zhì)和促炎介質(zhì)。它涉及細胞死亡、細胞凋亡和眾多疾病，包括多種炎性 和自身免疫狀況、膿毒癥、腦膜炎和神經(jīng)變性。HMGB1的過表達與癌癥的所有關(guān)鍵標志相關(guān) (Tang等人；2010)。HMGB1緊密附著至細胞凋亡細胞的染色質(zhì)。核小體-HMGB1復(fù)合物的研 究已顯示這些加合物在患有自身免疫疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的個體的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，并 且該加合物涉及其為SLE關(guān)鍵特征的抗核抗體的發(fā)展。未附著至HMGB1的核小體不引發(fā)免 疫應(yīng)答。這些加合物中HMGB1與核小體的結(jié)合通過下述加以證實：用針對DNA或組蛋白的 抗體免疫沉淀核小體，隨后為使用抗HMGB1抗體的蛋白質(zhì)印跡，以證實免疫沉淀的核小體 中 HMGB1 的存在（Urbonaviciute 等人；2008)。
[0018] HMGB蛋白質(zhì)與已知影響染色質(zhì)功能的許多其他蛋白質(zhì)相互作用，并且已顯示存在 涉及HMGB蛋白質(zhì)加上另外蛋白質(zhì)的染色質(zhì)復(fù)合物（Gerlitz等人；2009)。因此，除簡單的 核小體-蛋白質(zhì)加合物之外，在染色質(zhì)中存在其中2種或多種蛋白質(zhì)與核小體結(jié)合的核小 體-蛋白質(zhì)-復(fù)合加合物（complex adduct)。
[0019] EZH2是多梳族（PcG)家族的成員，其形成涉及維持基因的轉(zhuǎn)錄阻遏狀態(tài)的多聚蛋 白質(zhì)復(fù)合物。EZH2是組蛋白修飾酶(組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶)，其甲基化核小體的組 蛋白3的賴氨酸27氨基酸殘基。該組蛋白修飾與染色質(zhì)凝聚和基因沉默相關(guān)（Cao等人； 2002)。
[0020] 核小體受體是在組蛋白或配體的控制下調(diào)節(jié)基因表達的分子，例如雌激素受體 (ER)調(diào)節(jié)雌激素依賴性基因的表達。這些蛋白質(zhì)中的許多涉及疾病過程，例如ER涉及乳腺 癌的進展，并且許多乳腺癌治療靶向ER和/或阻止ER與其配體雌二醇的相互作用。
[0021] 除細胞中存在的核小體-蛋白質(zhì)加合物之外，存在可以在細胞死亡后從細胞中釋 放核小體后形成的其他核小體-蛋白質(zhì)加合物。此類核小體加合物包括其為SLE關(guān)鍵特征 的核小體-免疫球蛋白加合物。
[0022] 我們目前報道用于直接估計生物樣品中的蛋白質(zhì)-核小體加合物的簡單免疫測 定方法。我們已開發(fā)用于檢測核小體結(jié)合的EZH2、HMGB1和幾種核受體的簡單方法，并且顯 示此類核小體加合物可以在血清樣品中進行檢測，并且它們具有作為疾病中的生物標志的 用途。
[0023] 發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標志用于診 斷癌癥、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于檢測樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在 的方法，其包括下述步驟： (i)使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii )使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋 白質(zhì)； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于檢測樣品中的核小體加合物的存在的方法， 其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測細胞中的核小體加合物的方法，其包 括下述步驟： (i) 從細胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 根據(jù)上述第二或第三方面中所述的本發(fā)明的ELISA方法，檢測或測量核小體加 合物的存在。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測或診斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測到的核小體加合物水平來鑒定個體的疾病狀態(tài)。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了評估動物或人個體對醫(yī)學(xué)治療的適合性的方 法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測到的核小體加合物水平作為選擇個體的合適治療的參數(shù)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于監(jiān)控動物或人個體的治療的方法，其包括 下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物； (ii) 在一個或多個場合重復(fù)個體體液中的核小體加合物的檢測或測量； (iii) 使用檢測到的核小體加合物水平中的任何改變作為個體狀況中的任何改變的參 數(shù)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志用于檢測或診 斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物； (ii) 檢測或測量健康個體或?qū)φ諅€體體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對照個體中檢測到的水平之間的差異，來鑒定核小體加合物是否 可用作疾病狀態(tài)的生物標志。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了依照本文限定的方法鑒定的生物標志。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測核小體加合物的試劑盒，其包括對于 核小體加合物或其組成部分、或DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物 特異性的配體或結(jié)合劑，連同試劑盒的使用說明書。
[0033] 附圖簡述 圖1 :用于檢測稀釋到馬血清內(nèi)的從Hela細胞中提取的消化染色質(zhì)中的核小體EZH2 加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0034] 圖2 :得自5個健康個體和11個患有腫瘤的個體的血清樣品的核小體-EZH2加合 物ELISA結(jié)果。
[0035] 圖3 :用于檢測稀釋到馬血清內(nèi)的從Hela細胞中提取的消化染色質(zhì)中的核小 體-HMGB1加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0036] 圖4 :得自5個健康個體和11個患有腫瘤的個體的血清樣品的核小體-HMGB1加 合物ELISA結(jié)果。
[0037] 圖5:得自31個健康個體和74個患有（A)結(jié)腸癌、（B)乳腺癌或（C)肺癌的個體 的血清樣品的核小體-HMGB1加合物ELISA結(jié)果。
[0038] 圖6 :在通過*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細胞游離核小體中，用于檢 測核小體-孕酮受體加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0039] 圖7 :在2個前列腺癌病例和通過*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細胞游 離核小體樣品中，用于檢測核小體-雄激素受體加合物水平的ELISA結(jié)果。
[0040] 圖8 :在通過*Holdenrieder等人；2001的方法制備的細胞游離核小體中，用于檢 測核小體-雌激素受體a (ERa )加合物水平的ELISA劑量應(yīng)答曲線。
[0041] 圖9 :用于檢測消化的MCF7染色質(zhì)中的核小體-ERi3加合物水平的ELISA結(jié)果。 該測定以兩種不同形式進行。在第一形式中，將抗核小體抗體包被到孔上，并且使抗ER3 抗體生物素化。在第二形式中，將抗ERi3抗體包被到孔上，并且使抗核小體抗體生物素化。
[0042] 圖10 :核小體[email protected]加合物ELISA結(jié)果。
[0043] 圖11 :得12個健康個體和16個患有腫瘤的個體的血清樣品的核小體-ERP加合 物ELISA結(jié)果。
[0044] 發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標志用于診 斷癌癥、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。在一個實施方案中，生物標志用于診斷癌癥。我 們已顯不含有HMGB1和EZH2的兩種此類加合物存在于患有癌癥的個體的循環(huán)中，但在健康 個體的循環(huán)中未檢測到。
[0045] 本領(lǐng)域眾所周知癌癥可以是激素依賴性的，并且需要激素的存在用于生長。還眾 所周知核激素通過受體結(jié)合的激素復(fù)合物的核定位以及與基因組中的特定激素應(yīng)答元件 結(jié)合來起作用。與元件相關(guān)的基因的表達通過受體結(jié)合的激素復(fù)合物與基因組應(yīng)答元件的 結(jié)合進行調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了激素受體-核小體加合物和激素-激素 受體-核小體復(fù)合加合物生物標志，用于表征個體的腫瘤狀態(tài)。這些加合物可以是血液或 另一種體液中存在的循環(huán)加合物，或可以通過來自腫瘤組織樣品的染色質(zhì)消化而產(chǎn)生。
[0046] 本領(lǐng)域眾所周知核激素受體在激素或配體的控制下調(diào)節(jié)基因表達。例如，雌激素 受體通過結(jié)合其在細胞表面膜處的底物(類固醇激素雌激素)起作用。結(jié)合隨后為激素-受 體復(fù)合物的內(nèi)在化和核內(nèi)定位，其中受體與基因組中的特定激素應(yīng)答元件結(jié)合。雌激素受 體與之結(jié)合的特定基因序列被稱為雌激素應(yīng)答兀件（ERE)。與ERE相關(guān)的基因的表達可以 通過受體調(diào)節(jié)，并且因此通過個體循環(huán)中的雌激素的存在或水平調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域還眾所周知 乳腺癌的生長通常處于雌激素控制下，并且此類癌癥通常被稱為雌激素依賴性的。因為這 些腫瘤過表達雌激素受體（ER)，所以它們通常被稱為ER+腫瘤。雌激素依賴性腫瘤的生長 可以通過旨在阻止雌激素與雌激素受體結(jié)合的治療干預(yù)得到減慢或阻止，并且這是乳腺癌 治療的常見方法。此類治療的實例包括下述藥物：充當雌激素依賴性乳腺癌中的雌激素拮 抗劑的他莫昔芬，和減慢或阻止雌激素產(chǎn)生的芳香酶抑制劑。然而，隨著時間過去，癌癥發(fā) 展成雌激素非依賴性腫瘤，其即使在不存在雌激素刺激的情況下也生長，并且需要不同治 療。雌激素依賴性和非依賴性腫瘤的診斷目前常規(guī)通過免疫染色腫瘤活組織檢查組織進 行，以測定腫瘤細胞中雌激素受體的豐度或其他方面。臨床醫(yī)生可能需要在腫瘤治療過程 期間反復(fù)再測試腫瘤的雌激素依賴性，以確定進一步的雌激素依賴性治療是否適合或個體 的治療方案是否應(yīng)改變，以反映隨著疾病進展腫瘤的改變性質(zhì)。不幸的是，目前測試是次優(yōu) 的，并且需要在進行測試的每個場合的重復(fù)疼痛的活組織檢查。在本發(fā)明的一個實施方案 中，將在乳腺癌患者的循環(huán)中雌激素受體-核小體加合物的檢測用作腫瘤細胞的細胞核中 雌激素受體與ERE結(jié)合的指標作為腫瘤的雌激素依賴性的指標，以幫助選擇適當治療和預(yù) 測性預(yù)后信息。該方法具有指示腫瘤中的ERE-雌激素受體結(jié)合，而不是雌激素受體的存在 或豐度的簡單指標的優(yōu)點，并且它可以如簡單血液測試所需要的一樣頻繁地重復(fù)，而無需 活組織檢查。我們已開發(fā)用于檢測和定量含有受體的ERa和ERi3形式的核小體-ER加合 物的簡單ELISA方法。令人驚訝的是，這些加合物存在于癌癥患者的循環(huán)中。
[0047] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，相同原理可以應(yīng)用于檢測由腫瘤組織自身產(chǎn)生的細 胞染色質(zhì)消化物中的雌激素受體-核小體加合物。這種評價腫瘤的雌激素依賴性的方法優(yōu) 于目前方法，因為它指示腫瘤中的ERE-雌激素受體結(jié)合，而不是雌激素受體的存在或豐度 的簡單指標。
[0048] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，將在循環(huán)中、或在另一種體液中、或在作為來自腫 瘤組織的染色質(zhì)消化物產(chǎn)生的核小體中，在雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物中的 類固醇雌激素自身的存在的檢測，用作腫瘤的雌激素依賴性狀態(tài)的指標。
[0049] 據(jù)報道循環(huán)核小體在子宮內(nèi)膜異位癥中是升高的（Holdenrieder等人；2001)，并 且因為子宮內(nèi)膜異位癥組織是雌激素響應(yīng)的，所以在子宮內(nèi)膜異位癥細胞的染色質(zhì)中雌激 素受體的結(jié)合可以導(dǎo)致在循環(huán)中的雌激素受體-核小體加合物或雌激素-雌激素受體-核 小體復(fù)合加合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，在體液中檢測雌激素受體-核小體加合 物或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物，作為雌激素依賴性婦科狀況(包括例如子宮 內(nèi)膜異位癥）存在的生物標志。
[0050] 以與雌激素依賴性乳腺癌相似的方式，雄激素依賴性前列腺癌的生長需要雄激素 或由雄激素加速。雄激素依賴性前列腺腫瘤類似地通過阻止雄激素與雄激素受體(AR)結(jié) 合的方法進行治療。雄激素依賴性前列腺腫瘤還可以發(fā)展變成雄激素非依賴性的，并且因 此對治療(包括物理閹割或通過藥物的化學(xué)閹割，以阻止雄激素與其受體結(jié)合）是抗性的。 腫瘤的雄激素依賴性狀態(tài)可以通過雄激素受體與基因組中的雄激素應(yīng)答元件（ARE)的結(jié)合 水平來確定，并且這可以通過分析個體循環(huán)或來自前列腺組織的染色質(zhì)消化物中存在的雄 激素受體-核小體加合物水平進行確定。用于該目的的本發(fā)明實施方案包括在個體循環(huán)或 體液或者由來自個體腫瘤組織的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的核小體中，雄激素受體-核小體加合物 或雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物的檢測。我們目前已開發(fā)用于檢測和定量核小 體-AR加合物的簡單ELISA方法，且證實其效用。我們還已開發(fā)用于檢測和定量核小體-孕 酮受體加合物的簡單ELISA方法。其他激素依賴性疾病可以用本發(fā)明方法的相似實施方案 加以解決。此類實施方案包括檢測其他受體-核小體加合物，包括例如糖皮質(zhì)激素受體、甲 狀腺激素受體和視黃酸受體-核小體加合物，用于檢測腫瘤包括例如涉及視黃酸受體的多 個類型的白血病。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，上文描述的方法可以用于檢測激素-激素受體-核小 體復(fù)合加合物。在一個實施方案中，激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物包含甲狀腺素-甲 狀腺激素受體-核小體復(fù)合加合物、三碘甲狀腺原氨酸-甲狀腺激素受體-核小體復(fù)合加 合物、視黃酸-視黃酸受體-核小體復(fù)合加合物、雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物、 或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物。本發(fā)明的這個方面具有區(qū)分激素活化的加合 物以及含有野生型或正常激素受體的加合物，與例如由于在疾病進展的過程中（例如在雌 激素非依賴性乳腺癌中）的突變而不結(jié)合其配體的激素受體的優(yōu)點。本發(fā)明的這個方面可 以以多種方式進行。在一個實施方案中，使用定向結(jié)合激素自身的抗體或其他結(jié)合劑，代替 定向結(jié)合激素受體的抗體。在可替代實施方案中，激素從抗體捕獲的激素-激素受體-核 小體復(fù)合加合物中提取，并且通過建立的方法定量，所述方法例如免疫測定法、光譜法或色 譜法，包括高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜法隨后為質(zhì)譜法（LC/MS)或氣相色譜法隨后 為質(zhì)譜法（GC/MS)。例如，雄激素-雄激素受體-核小體復(fù)合加合物通過定向結(jié)合加合物上 (例如在雄激素受體或核小體上)存在的表位的固定抗體捕獲。激素隨后從固相結(jié)合的加合 物提取到有機溶劑(例如二乙醚)內(nèi)。將溶劑轉(zhuǎn)移，干燥且將雄激素再溶解于測定緩沖液中， 并且測量其濃度(例如通過競爭性免疫測定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，該實施方案將 具有用于小分子激素例如類固醇和甲狀腺激素的特定應(yīng)用。
[0052] 本發(fā)明旨在檢測與核小體結(jié)合的蛋白質(zhì)。這可以借助于雙抗體ELISA測試完成， 其中一種抗體定向結(jié)合核小體，并且另一種定向結(jié)合與核小體結(jié)合的蛋白質(zhì)。然而，定向結(jié) 合核小體的抗體無需定向整體核小體復(fù)合物，而是可以定向核小體的蛋白質(zhì)或核酸組成部 分。在本發(fā)明的這個實施方案中，用于結(jié)合核小體的抗體可以定向結(jié)合核小體的任何組成 部分，包括例如特定組蛋白、組蛋白修飾、組蛋白變體或同種型、或特定核苷酸或經(jīng)修飾的 核苷酸。我們已顯示這種測定設(shè)計使用定向結(jié)合組蛋白變體H2AZ的抗體作為核小體的結(jié) 合劑的實例良好工作。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，該方法具有僅選擇性結(jié)合含有加合物 中的目的蛋白質(zhì)和H2AZ的那些核小體的另外優(yōu)點。該設(shè)計提供用于測試加合物蛋白質(zhì)與 任何特定組蛋白、組蛋白修飾、組蛋白變體、核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或其他核小體結(jié)構(gòu)的 任何組合的測定方法。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于檢測樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在 的方法，其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋 白質(zhì)； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0054] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，待檢測的結(jié)合試劑可以選擇為針對加合蛋白質(zhì)或者 針對核小體或核小體的組成部分的抗體。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于檢測樣品中的核小體加合物的存在的方法， 其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體加合物的存在的量度。
[0056] 在一個實施方案中，核小體加合物包括促炎蛋白、高速泳動族蛋白、多梳蛋白、染 色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。在可替代實施方案中，核小體加合物包括高速泳動族蛋白、多 梳蛋白、染色質(zhì)修飾酶、激素受體或激素。在進一步的實施方案中，核小體加合物包括染色 質(zhì)修飾酶、核受體或激素。在進一步的實施方案中，高速泳動族蛋白是HMGB1。在一個實施 方案中，當生物標志用于診斷癌癥時，核小體-蛋白質(zhì)加合物包括高速泳動族蛋白。
[0057] 在一個實施方案中，染色質(zhì)修飾酶是組蛋白乙?；⑷ヒ阴；?、甲基化、去甲基化、 磷酸化、去磷酸化、泛素化（ubiquitination)、去泛素化、蘇素化（sumoylation)、去蘇素化 或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶酶。在可替代實施方案中，染色質(zhì)修飾酶是EZH2。
[0058] 在一個實施方案中，當核小體-蛋白質(zhì)加合物包括核受體時，所述核受體是雌激 素受體、雄激素受體、孕酮受體、甲狀腺激素受體、糖皮質(zhì)激素受體或視黃酸受體。在可替代 實施方案中，當核小體-蛋白質(zhì)加合物包括核受體時，所述核受體是雌激素受體、雄激素受 體或視黃酸受體。
[0059] 在一個實施方案中，當核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素時，所述激素是甲狀腺激 素、糖皮質(zhì)激素或類固醇激素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮質(zhì)類固醇或視黃酸。在可 替代實施方案中，當核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素時，所述激素是類固醇激素，包括雌激 素、雄激素、皮質(zhì)類固醇或視黃酸。
[0060] 在一個實施方案中，當核小體-蛋白質(zhì)加合物包括激素受體時，所述激素受體是 雌激素受體、雄激素受體、孕酮受體、甲狀腺激素受體或視黃酸受體。
[0061] 我們已顯示該方法可以使用與定向結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)的抗體組合的針 對核小體自身的抗體進行，或使用再次與定向結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)的抗體組合的針 對核小體組分的抗體進行。在一個實施方案中，核小體或核小體組分抗體或結(jié)合劑定向結(jié) 合特定表觀遺傳核小體表位；例如任何組蛋白變體(例如H2AZ)、任何組蛋白修飾(例如三 甲基H3K9)或任何核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸(例如5-甲基胞嘧啶)。在可替代實施方案中， 核小體或核小體組分結(jié)合劑定向結(jié)合特定表觀遺傳信號結(jié)構(gòu)，使得僅檢測含有所述表觀遺 傳信號結(jié)構(gòu)的核小體加合物的特定子集。
[0062] 在一個實施方案中，使用的結(jié)合試劑是抗體、抗體片段或適體。在進一步的實施方 案中，使用的結(jié)合試劑是抗體。
[0063] 在一個實施方案中，樣品是生物流體。在進一步的實施方案中，樣品是血液或血清 或血漿。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，體液中的核小體加合物的檢測具有是不需要活組織 檢查的最低限度侵入性方法的優(yōu)點。
[0064] 然而，在一些情況下，可能優(yōu)選直接通過下述評價細胞的核小體加合物狀態(tài)：由該 細胞產(chǎn)生核小體，并且就特定核小體加合物的存在分析核小體。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測細胞中的核小體加合物的方法，其包 括下述步驟： (i) 從細胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 根據(jù)上述第二至第六方面中任一項所述的本發(fā)明的ELISA方法，檢測或測量核 小體加合物的存在。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測或診斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測到的核小體加合物水平來鑒定個體的疾病狀態(tài)。
[0067] 在本發(fā)明的一個實施方案中，樣品中核小體加合物的存在用于確定需要此類治療 的個體中的最優(yōu)治療方案。此類實施方案的一個實例是檢測核激素受體-核小體加合物或 激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物，用于評價腫瘤的激素依賴性。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于評價動物或人個體對醫(yī)學(xué)治療的適合性的 方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物；和 (ii) 使用檢測到的核小體加合物水平作為選擇個體的合適治療的參數(shù)。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于監(jiān)控動物或人個體的治療的方法，其包括 下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物； (ii) 在一個或多個場合重復(fù)個體體液中的核小體加合物的檢測或測量； (iii) 使用檢測到的核小體加合物水平中的任何改變作為個體狀況中的任何改變的參 數(shù)。
[0070] 在一個實施方案中，檢測或測量核小體加合物作為一組測量之一。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了單獨或作為一組測量的部分的用于檢測或測量 核小體加合物的方法，其用于以下目的：檢測或診斷疾病狀態(tài)，或用于評價動物或人個體對 醫(yī)學(xué)治療的適合性，或用于監(jiān)控動物或人個體的治療，所述方法用于在患有實際或可疑癌 癥、良性腫瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、傳染病、膿毒癥、中風(fēng)或心肌梗塞 的個體中。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志用于檢測或診 斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量個體體液中的核小體加合物； (ii) 檢測或測量健康個體或?qū)φ諅€體體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對照個體中檢測到的水平之間的差異，來鑒定核小體加合物是否 可用作疾病狀態(tài)的生物標志。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測核小體加合物的試劑盒，其包括對于 核小體加合物或其組成部分、或DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物 特異性的配體或結(jié)合劑，連同試劑盒的使用說明書。
[0074] 除組蛋白和核酸組分之外，已知染色質(zhì)含有廣泛多樣的蛋白質(zhì)，其執(zhí)行廣泛范圍 的功能。我們選擇HMGBUEZH2和幾種核受體作為這些蛋白質(zhì)的實例，并且已開發(fā)用于檢測 這些蛋白質(zhì)的單核小體和寡核小體加合物的簡單ELISA方法。我們直接對得自健康和患病 個體的血清樣品進行這些ELISA方法，并且該方法不需要樣品提取或其他樣品預(yù)處理。令 人驚訝的是，我們已顯示這些核小體加合物可以在癌癥個體的血清中檢測到，并且核小體 加合物ELISA測定可用于疾病狀態(tài)的檢測和診斷。
[0075] HMGB1是與細胞死亡、細胞凋亡和眾多疾病相關(guān)的損傷相關(guān)分子模式（DAMP)蛋白 質(zhì)，所述疾病包括多種炎性和自身免疫狀況、膿毒癥、腦膜炎、神經(jīng)變性、SLE和癌癥（Tang 等人；2010)。升高的HMGB1表達在許多癌癥中發(fā)生，并且被認為與侵入和轉(zhuǎn)移相關(guān)（Sims等 人，2010)。升高的HMGB1水平也在癌癥患者的血液中以及多種其他狀況下發(fā)生（Stoetzer 等人，2012)。循環(huán)HMGB1可以通過ELISA進行測量，但此類測量不用于常規(guī)臨床實踐中， 因為循環(huán)HMGB1以結(jié)合和游離形式存在，并且目前可用于區(qū)分這些的蛋白質(zhì)免疫印跡方 法不適合于常規(guī)用途。因此，存在區(qū)分游離HMGB1和HMGB1復(fù)合物的可靠方法的需要 (Urbonaviciute和Voll，2011)。重要種類的循環(huán)HMGB1復(fù)合物是HMGB1-核小體加合物， 并且本發(fā)明的一個實施方案針對HMGB1-核小體加合物及其他HMG-核小體加合物的檢測。 我們已顯示HMG-核小體加合物可以使用快速和簡單的ELISA方法，在癌癥患者的血液中進 行測量。
[0076] HMGB1緊密附著至細胞凋亡細胞的染色質(zhì)。核小體-HMGB1復(fù)合物的研究已顯示這 些加合物在患有自身免疫疾病SLE的個體的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，并且加合物涉及其為SLE關(guān)鍵特 征的抗核抗體的發(fā)生。這些加合物在循環(huán)中的存在仍未用于臨床診斷目的，因為用于其檢 測的蛋白質(zhì)印跡方法是昂貴、緩慢和費力的，并且不適合于常規(guī)臨床用途。本發(fā)明克服了這 些缺點。
[0077] EZH2是染色質(zhì)修飾酶(組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶)，其甲基化核小體的組蛋白 3的賴氨酸27氨基酸殘基，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和基因沉默（Cao等人；2002)。該蛋白質(zhì)已知結(jié) 合活細胞的細胞核中的染色質(zhì)。令人驚訝的是，我們已顯不EZH2在細胞死亡后保持與核小 體結(jié)合，并且使用本發(fā)明的新ELISA方法，可以在癌癥個體的血清中檢測到單核小體-EZH2 和寡核小體-EZH2加合物。
[0078] 已知染色質(zhì)修飾酶涉及癌癥（Fullgrabe等人，2011)，并且通過使用祀向藥物抑 制這些酶的活性是主要形式的癌癥治療。這些藥物包括例如但不限于組蛋白去乙?；瘡?fù)合 物抑制劑（HDACi)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（HMTi)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTi)。雖 然HMGB1加合物在循環(huán)中的存在已知是病理的，并且與抗核抗體相關(guān)，但染色質(zhì)修飾酶-核 小體加合物存在于循環(huán)中的發(fā)現(xiàn)先前未得到報道。染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物的測定具 有在癌癥中的多種用途，包括例如評價癌癥疾病狀態(tài)和測定染色質(zhì)修飾酶抑制劑藥物的功 效，例如測定循環(huán)染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物的水平是否通過用特定藥物的治療改變。 本發(fā)明的方法可以用于測定循環(huán)染色質(zhì)修飾酶-核小體加合物水平，用于廣泛多樣的疾病 診斷目的，包括疾病檢測、監(jiān)控、預(yù)后、鑒別診斷和選擇治療方案。我們已顯示含有HMT酶 EZH2的核小體加合物可以在癌癥患者的循環(huán)中檢測到。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，本發(fā) 明的方法可以應(yīng)用于其他染色質(zhì)修飾酶，包括以前提及的HDAC和DNMT酶以及許多其他酶， 包括例如用于組蛋白乙酰化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、蘇素化和去 蘇素化的酶。
[0079] 核受體在配體激素控制下在細胞核中發(fā)揮其基因調(diào)節(jié)作用。實例包括類固醇激素 受體、甲狀腺受體、糖皮質(zhì)激素受體以及視黃酸和維生素 D受體。這些受體涉及多種癌癥及 其他疾病機制。一些實例包括視黃酸受體（RAR)在白血病中的涉及、雌激素受體（ER)在乳 腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥中的涉及、雄激素受體(AR)在前列腺癌中的涉及、以及甲狀腺激素 受體在甲狀腺疾病和癌癥中的涉及。
[0080] 令人驚訝的是，我們已顯示核受體-核小體加合物可以在癌癥患者的循環(huán)中檢測 到。
[0081] 因此，我們選擇研究的所有細胞內(nèi)染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)可以以核小體加合物的形式 在癌癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)指示此類加合物可能不是罕見的，并且涉及許多不同 染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的許多此類細胞內(nèi)核小體蛋白質(zhì)加合物可以在細胞死亡后保留其完整 性，并且順應(yīng)通過本發(fā)明的方法在癌癥、自身免疫和炎性疾病患者的血清中的檢測。
[0082] 我們已使用與適當?shù)奶禺愋钥谷旧|(zhì)蛋白質(zhì)(抗HMGB1、抗EZH2或抗核受體)抗體 組合的抗組蛋白抗體，作為用于這些測定的捕獲抗體。我們已使用測定以顯示含有特定蛋 白質(zhì)的核小體加合物可以在得自患有癌癥的個體的血樣中進行測量，并且區(qū)別用作非侵入 性或最低限度侵入性生物標志。在得自患病個體的血清樣品中檢測到的核小體-加合物水 平不同于在來自健康個體的血清樣品中檢測到的那些。
[0083] 我們測量得自3個患有結(jié)腸癌的個體、6個患有肺癌的個體和2個患有胰腺癌的個 體的血樣中的循環(huán)細胞游離核小體-HMGB1和核小體-EZH2加合物水平，并且比較這些與來 自5個健康個體的血樣中存在的水平，以及如文獻（*Holdenrieder等人，2001)中所述制備 的來自健康個體的人工產(chǎn)生的血清核小體制劑，和通過由Hela細胞提取的染色質(zhì)消化制 備的商購可得的核小體制劑。
[0084] 對于核小體-HMGB1和核小體-EZH2加合物，由5個健康個體的結(jié)果計算正常范圍 (平均結(jié)果土平均值的2個標準差)，并且檢查癌癥個體的結(jié)果以查看它們是落入各自正常 范圍Z內(nèi)還是Z外。數(shù)據(jù)顯不3個結(jié)腸癌樣品中的2個、6個肺癌樣品中的4個和2個胰 腺癌樣品中的1個具有升高的核小體-HMGB1加合物水平，并且類似地3個結(jié)腸癌樣品中的 2個、6個肺癌樣品中的4個和2個胰腺癌樣品中的1個具有升高的核小體-EZH2加合物水 平(光密度結(jié)果高于正常范圍的頂端)。
[0085] 我們已類似地測量健康和患病患者中的核受體-核小體加合物水平，并且顯示這 些存在于癌癥患者的血清中。
[0086] 與染色質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)包括但不限于核受體、高速泳動族蛋白（例如HMGB1)、多梳 蛋白、染色質(zhì)修飾酶(例如EZH2)、DNA修飾酶、核受體、轉(zhuǎn)錄因子、構(gòu)筑或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄 增強因子、轉(zhuǎn)錄阻遏因子、復(fù)制蛋白、DNA損傷修復(fù)蛋白以及涉及基因表達、染色質(zhì)包裝或復(fù) 制控制的任何其他蛋白質(zhì)。
[0087] 核小體加合物還可以由于細胞死亡后在生物流體（biological fluid)中存在的 核小體的結(jié)合而存在。此類加合物的實例將是自身免疫疾病例如SLE形成的核小體-抗體 加合物。
[0088] 因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了用于檢測或測量核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合 物或加合物的存在的方法。待測量的核小體加合物可以具有任何起源，包括但不限于由于 健康或患病狀況在生物流體中存在的天然存在的核小體加合物，或核小體加合物可以通過 由細胞提取的染色質(zhì)消化而產(chǎn)生，或它們可以通過誘導(dǎo)的細胞凋亡或細胞壞死而產(chǎn)生(例 如通過*Holdenrieder等人；2001的方法)。令人驚訝的是，我們已顯示核小體加合物在所 有這些情形下存在，并且可以通過本發(fā)明的方法進行檢測。
[0089] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了用于檢測或測量生物流體中的核小體-蛋 白質(zhì)加合物的存在的方法。
[0090] 在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了通過就一種或多種核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合物 或加合物的存在或水平測試個體樣品，用于檢測或診斷疾病的存在、類型、復(fù)發(fā)或嚴重性， 或評價最優(yōu)藥物或其他治療選項的方法。
[0091] 在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了通過就核小體-蛋白質(zhì)復(fù)合物或加合物的 存在或水平測試得自個體的樣品作為一組測試的部分，用于檢測或診斷疾病的存在、類型、 復(fù)發(fā)或嚴重性，或評價最優(yōu)藥物或其他治療選項的方法。用于檢測含有不同組蛋白修飾的 細胞游離核小體的ELISA方法已得到報道（Bawden等人；2005)。
[0092] 因此，此類一組測試可以由例如含有不同核小體表位的核小體的兩種或更多種測 量組成；包括但不限于不同加合物和/或組蛋白修飾和/或組蛋白變體和/或經(jīng)修飾的核 苷酸和/或核小體自身的測量，或這些中的任何和任何其他核小體表位的任何組合或比， 作為個體的健康或疾病狀態(tài)的指標。
[0093] 我們得出結(jié)論本發(fā)明的方法是用于檢測和測量含有特定蛋白質(zhì)的核小體加合物 的成功方法，并且該方法是比本領(lǐng)域的方法更佳的用于檢測核小體加合物的方法。該方法 是快速、低成本的且適合用于復(fù)雜生物介質(zhì)和流體，包括血液及其衍生物。我們已證實本發(fā) 明的方法可以用于檢測血液中的核小體加合物，并且這可以用作癌癥的生物標志。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將明確的是，血液中存在的生物標志具有用于癌癥及其他與升高的循環(huán)核小體相 關(guān)的疾病的廣泛范圍的診斷和疾病篩選目的的價值（Ho 1 denrieder等人，2001)。
[0094] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于檢測且測量樣品中的細胞游離核小體加合物 的雙抗體、免疫測足或夾心（sandwich)免疫測足萬法。這個萬面的一個實施萬案是免疫測 定，其包含下述步驟： (i) 使可能含有核小體加合物的樣品與第一抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第一抗體或 其他結(jié)合劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使核小體或樣品與第二抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第二抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合 可能作為核小體-蛋白質(zhì)加合物存在的蛋白質(zhì)； (iii) 檢測和/或定量所述第二抗體或其他結(jié)合劑與樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物 的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的量度。 [0095] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了通過免疫測量免疫測定用于檢測且測量樣品中 的細胞游離核小體加合物的方法，其包含下述步驟： (i)使可能包含含有特定蛋白質(zhì)的核小體加合物的樣品與第一抗體或其他結(jié)合劑接 觸，所述第一抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合目的蛋白質(zhì)； (ii )使核小體或樣品與第二抗體或其他結(jié)合劑接觸，所述第二抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合 核小體或其組分； (iii) 用結(jié)合樣品中的核小體或其組分的第二抗體或其他結(jié)合劑檢測和/或定量所述 第二抗體或其他結(jié)合劑與核小體樣品的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為樣品中核小體加合物的存在的量度。
[0096] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，在上文第一方面的階段（i)和上文第二方面的階段 (i i )中，用于結(jié)合核小體或其組分的抗體或其他結(jié)合劑可以是針對完整核小體或針對核小 體的任何組成部分的抗體(或其他結(jié)合劑)，包括但不限于針對組蛋白、組蛋白變體、組蛋白 修飾、核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或核小體的DNA組分的其他部分。因此，在本發(fā)明的進一步 方面，提供了用于(僅)檢測那些核小體-蛋白質(zhì)加合物的方法，所述核小體-蛋白質(zhì)加合物 另外含有該結(jié)合劑針對其的另一個特征，包括但不限于特定組蛋白修飾、組蛋白變體或核 苷酸。該設(shè)計的優(yōu)點在于測定的核小體組分表位和加合的蛋白質(zhì)表位可以選擇為其水平在 健康或患病患者，或處于研究下的其他患者狀態(tài)中極大不同的表位。因此有可能降低通過 測定檢測到的核小體比例，而增加測定的臨床選擇性或特異性。
[0097] 我們已使用與抗EZH2抗體結(jié)合的針對核小體組分H2AZ的抗體作為抗核小體抗 體，進行測定的該設(shè)計，并且顯示與H2AZ特異性相關(guān)的核小體-EZH2加合物可以通過此類 測定檢測，并且這些測定可以用于區(qū)分得自健康和患病個體的樣品。
[0098] 在本發(fā)明的進一步方面，待檢測的核小體加合物可以含有超過一種蛋白質(zhì)。加合 物中的進一步蛋白質(zhì)可以直接或間接結(jié)合核小體。例如，核小體可以結(jié)合HMGB蛋白質(zhì)，并 且另外結(jié)合進一步的一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)。進一步的一種或多種蛋白質(zhì)可以直接結(jié)合 核小體或可以結(jié)合HMGB蛋白質(zhì)，并且因此間接結(jié)合核小體。核小體加合物可以含有由多種 蛋白質(zhì)組分組成的大蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中復(fù)合加合物中的特定蛋白質(zhì)與核小體的結(jié)合可以 通過多種中間結(jié)合連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，核小體加合物中直接或間接結(jié)合核 小體的蛋白質(zhì)可以通過本發(fā)明的方法進行檢測。
[0099] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，所述本發(fā)明的方法包括多個實施方案，包括生物傳 感器型測定和例如由美國的ForteBio Incorporated銷售的無標記測定類型。
[0100] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測樣品中包含特定核小體加合物的核小 體比例的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量樣品中的核小體水平； (ii) 根據(jù)本發(fā)明的方法檢測或測量核小體加合物水平；和 (iii) 使用兩種測量來測定包含核苷酸加合物的核小體比例。
[0101] 我們已顯示得自個體的血液中的核小體加合物的檢測和測量可以用作診斷方法， 以鑒定患有癌癥的個體且區(qū)分其與健康個體。根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于檢測 或診斷疾病的存在的方法，通過測量或檢測體液中的細胞游離核小體加合物的存在和/或 水平或濃度，并且使用檢測的水平作為個體的疾病狀態(tài)的生物標志，包括但不限于疾病的 臨床診斷、疾病類型或亞型的鑒別診斷、或疾病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)、或?qū)χ委煼桨傅膫€體敏 感性的診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解用于診斷測試的體液包括但不限于血液、血清、血 漿、尿、腦脊液及其他流體。在一個優(yōu)選實施方案中，選擇為樣品的體液是血液、血清或血 漿。體液中的核小體加合物的測定應(yīng)答、水平、濃度或數(shù)量可以表示為絕對項或相對項，例 如但不限于作為存在的總核小體水平的比例，或者作為與含有另一種核小體結(jié)構(gòu)如組蛋白 修飾的核小體水平或與總DNA水平的比例。
[0102] 在本發(fā)明的一個實施方案中，核小體加合物測量用作測試的診斷組的成員或用于 檢測或診斷個體的疾病狀態(tài)的測量，包括但不限于疾病的臨床診斷、疾病類型或亞型、或疾 病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)的鑒別診斷、或?qū)χ委煼桨傅膫€體敏感性的診斷。
[0103] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于檢測或測量細胞中的蛋白質(zhì)的染色質(zhì)結(jié)合 的存在和/或水平的方法，其包括下述步驟： (i) 從細胞中分離染色質(zhì)； (ii) 分解染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體；和 (iii) 借助于本發(fā)明的免疫測定方法，檢測或測量單核小體和/或寡核小體中的核小 體加合物的存在。
[0104] 用于由染色質(zhì)產(chǎn)生單核小體和/或寡核小體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包 括酶消化和超聲處理（Dai等人，2011)。我們已證實用于由Hela和MCF7細胞產(chǎn)生的核小 體的這個方面。
[0105] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，就本發(fā)明的任何方面而言的術(shù)語抗體、結(jié)合劑或配 體不是限制性的，而是旨在包括抗體片段、適體或任何能夠與特定分子或?qū)嶓w結(jié)合的結(jié)合 齊IJ，并且任何合適的結(jié)合劑均可用于本發(fā)明的方法中。還將明確的是，術(shù)語核小體旨在包括 單核小體和寡核小體，以及可以在流體介質(zhì)中分析的任何此類染色質(zhì)片段。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于檢測或測量核小體加合物的試劑盒，其包 括對于核小體加合物或其組成部分、或核小體加合物或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特 異性的配體或結(jié)合劑，連同依照本文定義的任何方法的試劑盒的使用說明書。
[0107] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志用于檢測或診 斷動物或人中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量患病個體的體液中的細胞游離核小體加合物的水平； (ii) 檢測或測量對照個體的體液中的細胞游離核小體加合物的水平；和 (iii) 使用患病和對照個體中檢測到的水平之間的差異，來鑒定核小體加合物是否可 用作該疾病的生物標志。
[0108] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，對照個體可以在多種基礎(chǔ)上加以選擇，所述基礎(chǔ)可 以包括例如已知不患有疾病的個體，或可以是患有不同疾病的個體(例如，用于研究鑒別診 斷)。
[0109] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志用于評價患病 動物或人個體的預(yù)后的方法，其包括下述步驟： (i) 檢測或測量患病個體的體液中的細胞游離核小體加合物的水平；和 (ii) 使患病個體的體液中檢測的細胞游離核小體加合物的水平與個體的疾病結(jié)果關(guān) 聯(lián)。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志的方法，所述 核小體加合物生物標志待用于選擇需要治療的患病動物或人個體的治療方案，所述方法包 括下述步驟： (i)檢測或測量患病個體的體液中的細胞游離核小體加合物的水平；和 (i i )使患病個體的體液中檢測的細胞游離核小體加合物的水平與那些個體中觀察到 的治療方案功效關(guān)聯(lián)。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定核小體加合物生物標志的方法，所述 核小體加合物生物標志待用于監(jiān)控患病動物或人個體的治療，所述方法包括下述步驟： (i)檢測或測量患病個體的體液中的細胞游離核小體加合物的水平； (ii )在個體的疾病進展過程中的一個或多個場合，重復(fù)所述檢測或測量；和 (iii) 使患病個體的體液中檢測的細胞游離核小體加合物的水平與個體中的疾病進展 關(guān)聯(lián)。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了通過如本文定義的方法鑒定的生物標志。
[0113] 本發(fā)明的進一步方面提供了能夠與生物標志特異性結(jié)合的配體或結(jié)合劑，例如天 然存在的或化學(xué)合成的化合物。根據(jù)本發(fā)明的配體或結(jié)合劑可以包含能夠與生物標志特異 性結(jié)合的肽、抗體或其片段，或合成配體例如塑料抗體，或適體或寡核苷酸?？贵w可以是能 夠與生物標志特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。根據(jù)本發(fā)明的配體可以用可檢測標記物 進行標記，所述可檢測標記物例如發(fā)光、熒光、酶或放射性標記物；或者或另外地，根據(jù)本發(fā) 明的配體可以用親和標簽進行標記，所述親和標簽例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物 素蛋白或His (例如六His)標簽?；蛘撸潴w結(jié)合可以使用無標記技術(shù)例如ForteBio Inc 的技術(shù)進行測定。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以包括能夠與針對生物標志的抗體特異性結(jié)合的生 物標志或其結(jié)構(gòu)/形狀模擬物。還提供的是包含如本文描述的配體或模擬物的陣列。
[0115] 本發(fā)明還提供的是如本文描述的一種或多種配體的用途，或本發(fā)明的生物傳感 器、或本發(fā)明的陣列或本發(fā)明的試劑盒檢測和/或定量生物標志的用途，所述一種或多種 配體可以是天然存在的或化學(xué)合成的，并且適合地是肽、抗體或其片段，適體或寡核苷酸。 在這些用途中，檢測和/或定量可以對如本文定義的生物樣品進行。
[0116] 提供用于進行本發(fā)明的方法的診斷或監(jiān)控試劑盒。此類試劑盒適當?shù)匕ㄓ糜跈z 測和/或定量生物標志的根據(jù)本發(fā)明的配體，和/或生物傳感器，和/或如本文描述的陣 列，任選連同試劑盒的使用說明書。
[0117] 本發(fā)明的進一步方面是用于檢測疾病狀態(tài)的存在的試劑盒，其包括能夠檢測和/ 或定量如本文定義的一種或多種生物標志的生物傳感器。
[0118] 用于檢測疾病存在的生物標志是用于發(fā)現(xiàn)新靶和藥物分子的必需靶，所述新靶和 藥物分子延緩或停止病癥的進展。因為生物標志的水平指示病癥和藥物應(yīng)答，所以生物標 志可用于在體外和/或體內(nèi)測定中鑒定新治療化合物。本發(fā)明的生物標志可以用于篩選化 合物的方法中，所述化合物調(diào)節(jié)生物標志的活性。
[0119] 因此，在本發(fā)明的進一步方面，提供了如所述的結(jié)合劑或配體的用途，所述結(jié)合劑 或配體可以是根據(jù)本發(fā)明的肽、抗體或其片段或適體或寡核苷酸；或根據(jù)本發(fā)明的生物傳 感器、或根據(jù)本發(fā)明的陣列；或根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途，用于鑒定能夠促進和/或抑制 生物標志生成的物質(zhì)。
[0120] 還提供的是鑒定能夠促進或抑制個體中的生物標志生成的物質(zhì)的方法，其包括給 受試動物施用測試物質(zhì)，和檢測和/或定量來自個體的測試樣品中存在的生物標志水平。
[0121] 術(shù)語"生物標志"意指過程、事件或狀況的鑒別性的生物或生物衍生的指示物。生 物標志可以用于診斷例如臨床篩選和預(yù)后評價的方法中，以及用于監(jiān)控治療的結(jié)果、鑒定 最可能響應(yīng)特定治療處理的個體、藥物篩選和開發(fā)。生物標志及其用途對于鑒定新藥物治 療和發(fā)現(xiàn)藥物治療的新靶是有價值的。
[0122] 如本文使用的術(shù)語"檢測"和"診斷"包含疾病狀態(tài)的鑒定、證實和/或表征。根 據(jù)本發(fā)明的檢測、監(jiān)控和診斷方法可用于證實疾病的存在，通過評價發(fā)作和進展來監(jiān)控疾 病的發(fā)展，或評價疾病的好轉(zhuǎn)或消退。檢測、監(jiān)控和診斷方法還可用于評價臨床篩選、預(yù)后、 治療選擇、評估臨床利益的方法中，即用于藥物篩選和藥物開發(fā)。
[0123] 通過確定正確診斷，允許快速鑒定最適當?shù)闹委煟ㄒ虼藴p少不需要的對有害藥物 副作用的暴露)，并且降低復(fù)發(fā)率，有效診斷和監(jiān)控方法提供了非常有力的"個體解決方 案"，具有改進預(yù)后的潛力。
[0124] 在一個實施方案中，所述生物標志從腫瘤細胞中釋放。因此，根據(jù)本發(fā)明的進一 步方面，提供了用于檢測腫瘤生長的方法，其包括下述步驟：（i)測量生物樣品中的生物標 志，其與腫瘤細胞相關(guān)或從腫瘤細胞中釋放，和（ii)證實所述生物標志的水平與腫瘤大小、 分期、侵占性或散布相關(guān)。
[0125] 已知增加的細胞更新、細胞死亡和細胞凋亡導(dǎo)致增加的細胞游離核小體的循環(huán) 水平（Holdenrieder等人，2001 )。循環(huán)細胞游離核小體水平是非特異性指標，并且存在于 多種狀況中，包括炎性疾病、許多種良性和惡性狀況、自身免疫疾病、以及在創(chuàng)傷或缺血后 (Holdenrieder等人2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確的是，本發(fā)明將具有在其中循環(huán)核小體 已在個體中發(fā)現(xiàn)的多種疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用。這些包括但不限于創(chuàng)傷(例如，嚴重損傷或手 術(shù))、過度鍛煉(例如跑馬拉松)、中風(fēng)和心臟病發(fā)作、膿毒癥或其他嚴重感染和子宮內(nèi)膜異 位癥。
[0126] 本發(fā)明的免疫測定包括采用酶檢測方法(例如ELISA)的免疫測量測定、熒光標記 的免疫測量測定、時間分辨的熒光標記的免疫測量測定、化學(xué)發(fā)光免疫測量測定、免疫比濁 測定、微粒標記的免疫測量測定和免疫放射測定和競爭性免疫測定方法，包括標記的抗原 和標記的抗體競爭性免疫測定方法，其具有多種標記類型包括放射性、酶、熒光、時間分辨 的熒光和微粒標記。所有所述免疫測定方法均是本領(lǐng)域眾所周知的，參見例如Salgame等 人，1997 和 van Nieuwenhui jze #人，2003。
[0127] 在一個實施方案中，所述生物樣品包含體液。例如，可以在本發(fā)明的方法中測試的 生物樣品包括腦脊液（CSF )、全血、血液血清、血漿、月經(jīng)血、子宮內(nèi)膜流體、尿、唾液或其他 體液(糞便、淚液、滑液、痰)、呼氣例如凝結(jié)的呼氣、或由其的提取物或純化物或其稀釋物。 生物樣品還包括來自活個體的或死后獲得的樣本。樣品可以以通常方式進行制備(例如適 當時，稀釋或濃縮）且貯存。
[0128] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法在多個場合重復(fù)。該實施方案提供了允許經(jīng)過 一段時期監(jiān)控的檢測結(jié)果的優(yōu)點。此類安排將提供監(jiān)控或評價疾病狀態(tài)的治療功效的利 益。本發(fā)明的此類監(jiān)控方法可以用于監(jiān)控發(fā)作、進展、穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、復(fù)發(fā)和/或緩解。
[0129] 因此，本發(fā)明還提供了就懷疑患有此類疾病的個體中的疾病狀態(tài)監(jiān)控治療功效的 方法，其包括檢測和/或定量來自所述個體的生物樣品中存在的生物標志。在監(jiān)控方法中， 測試樣品可以在兩個或更多個場合獲得。該方法可以進一步包括比較測試樣品中存在的一 種或多種生物標志的水平，與一種或多種對照和/或例如在治療開始前，較早得自相同測 試個體，和/或在治療的較早階段來自相同測試個體的一種或多種先前測試樣品。該方法 可以包括檢測在不同場合獲得的測試樣品中的一種或多種生物標志的性質(zhì)或量中的改變。
[0130] 因此，根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于就人或動物個體中的疾病狀態(tài)監(jiān)控 治療功效的方法，其包括： (a) 定量如本文定義的生物標志的量；和 (b) 比較測試樣品中的所述生物標志的量與一種或多種對照和/或在較早時間得自相 同測試個體的一種或多種先前測試樣品中存在的量。
[0131] 相對于較早得自相同測試個體的先前測試樣品中的水平，測試樣品中的生物標志 水平中的改變可以指示所述治療對病癥或可疑病癥的有利效應(yīng)，例如穩(wěn)定或改善。此外，一 旦治療已完成，本發(fā)明的方法就可以定期重復(fù)，以便監(jiān)控疾病的復(fù)發(fā)。
[0132] 用于監(jiān)控治療功效的方法可以用于監(jiān)控現(xiàn)有治療和新治療在人個體和非人動物 中（例如動物模型中）的治療有效性。這些監(jiān)控方法可以并入新藥物質(zhì)和物質(zhì)組合的篩選 內(nèi)。
[0133] 在進一步的實施方案中，由于速效治療的更快速改變的監(jiān)控可以以數(shù)小時或數(shù)天 的更短間隔進行。
[0134] 根據(jù)本發(fā)明的進一步方面，提供了用于鑒定檢測疾病狀態(tài)的存在的生物標志的方 法。如本文使用的術(shù)語"鑒定"意指證實生物樣品中存在的生物標志的存在。定量樣品中 存在的生物標志的量可以包括測定樣品中存在的生物標志的濃度。鑒定和/或定量可以直 接對樣品或間接對由其的提取物或其稀釋物進行。
[0135] 在本發(fā)明的可替代方面，生物標志的存在通過檢測和/或定量能夠與生物標志特 異性結(jié)合的抗體或其片段(其由個體身體響應(yīng)所述生物標志而生成，并且因此存在于來自 具有疾病狀態(tài)的個體的生物樣品中）進行評價。
[0136] 鑒定和/或定量可以通過適合于鑒定來自個體的生物樣品中或者生物樣品的純 化物或提取物或者其稀釋物中的特定蛋白質(zhì)的存在和/或量的任何方法進行。在本發(fā)明的 方法中，定量可以通過測量一種或多種樣品中的生物標志的濃度進行?？梢栽诒景l(fā)明的方 法中測試的生物樣品包括如上文定義的生物樣品。樣品可以以通常方式進行制備(例如適 當時，稀釋或濃縮）且貯存。
[0137] 生物標志的鑒定和/或定量可以通過檢測生物標志或其片段進行，所述片段例如 具有C末端截短或具有N末端截短的片段。片段適當?shù)亻L度大于4個氨基酸，例如長度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸。特別指出與組蛋白尾部的序 列相同或相關(guān)的序列的肽是特別有用的組蛋白片段。
[0138] 生物標志可以例如通過SELDI或MALDI-T0F直接檢測?；蛘撸飿酥究梢越?jīng)由 與一種或多種配體的相互作用而直接或間接檢測，所述一種或多種配體例如能夠特異性結(jié) 合生物標志的抗體或其生物標志結(jié)合片段、或其他肽、或配體例如適體或寡核苷酸。配體或 結(jié)合劑可以具有可檢測標記，例如發(fā)光、熒光或放射性標記和/或親和標簽。
[0139] 例如，檢測和/或定量可以通過選自下述的一種或多種方法進行：SELDI (-T0F)、 MALDI (-T0F)、基于1-D凝膠的分析、基于2-D凝膠的分析、質(zhì)譜法（MS)、反相（RP)LC、大小 滲透(凝膠過濾)、離子交換、親和力、HPLC、UPLC及其他基于LC或LC MS的技術(shù)。適當?shù)腖C MS 技術(shù)包括 ICAT? (Applied Biosystems，CA，USA)或 iTRAQ? (Applied Biosystems，CA， USA)。還可以使用液相色譜法(例如高壓液相色譜法（HPLC)或低壓液相色譜法（LPLC))、薄 層色譜法、NMR (核磁共振）光譜法。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明的診斷或監(jiān)控方法可以包括通過SELDI T0F或MALDI T0F分析樣品，以 檢測生物標志的存在或水平。這些方法還適合于臨床篩選、預(yù)后、監(jiān)控治療的結(jié)果、鑒定最 可能響應(yīng)特定治療處理的個體，適合于藥物篩選和開發(fā)、和鑒定藥物治療的新靶。
[0141] 鑒定和/或定量分析物生物標志可以使用免疫學(xué)方法進行，其涉及能夠與生物 標志特異性結(jié)合的抗體或其片段。合適的免疫學(xué)方法包括夾心免疫測定例如夾心ELISA， 其中分析物生物標志的檢測使用兩種抗體進行，所述抗體識別分析物生物標志上的不同 表位；放射性免疫測定（RIA)，直接、間接或競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)，酶免疫測定 (EIA)，熒光免疫測定（FIA)，蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀和任何基于顆粒的免疫測定(例如使用 金、銀或乳膠顆粒，磁性顆粒，或量子點（Q-dots))。免疫學(xué)方法可以例如以微量滴定板或條 形式進行。
[0142] 在一個實施方案中，一種或多種生物標志可以替換為在生物途徑中的生物標志上 游或下游發(fā)現(xiàn)的分子、或該分子可測量的片段。
[0143] 對于疾病特異性的關(guān)鍵生物標志的鑒定對于診斷程序和治療方案的整合是關(guān)鍵 的。使用預(yù)測生物標志，可以開發(fā)適當?shù)脑\斷工具例如生物傳感器；相應(yīng)地，在本發(fā)明的方 法和用途中，鑒定和定量可以使用生物傳感器、微分析系統(tǒng)、微工程系統(tǒng)、微分離系統(tǒng)、免疫 色譜法系統(tǒng)或其他合適的分析裝置進行。生物傳感器可以并入免疫學(xué)方法用于檢測一種或 多種生物標志、電、熱、磁、光學(xué)(例如全息圖）或聲學(xué)技術(shù)。使用此類生物傳感器，能夠檢測 在生物樣品中發(fā)現(xiàn)的以預(yù)期濃度的一種或多種靶生物標志。
[0144] 如本文使用的，術(shù)語"生物傳感器"意指能夠檢測生物標志的存在的任何事物。生 物傳感器的實例在本文中描述。
[0145] 根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以包括能夠與生物標志特異性結(jié)合的如本文描述的 配體結(jié)合劑或配體。此類生物傳感器可用于檢測和/或定量本發(fā)明的生物標志。
[0146] 本發(fā)明的一種或多種生物標志可以使用下述進行檢測：并入基于"智能"全息圖的 技術(shù)的生物傳感器，或高頻聲學(xué)系統(tǒng)，此類系統(tǒng)特別順應(yīng)"條形碼"或陣列配置。
[0147] 在智遺全息圖傳感器（Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK)中，全息圖像存于 對與生物標志特異性反應(yīng)致敏的薄聚合物膜中。在暴露后，生物標志與聚合物反應(yīng)，導(dǎo)致由 全息圖展示的圖像中的改變。測試結(jié)果讀出可以是光亮度、圖像、顏色和/或圖像位置中的 改變。對于定量和半定量應(yīng)用，傳感器全息圖可以由眼閱讀，因此去除檢測設(shè)備的需要。當 需要定量測量時，簡單的顏色傳感器可以用于閱讀信號。樣品的不透明度或顏色不干擾傳 感器的操作。傳感器的形式允許用于同時檢測幾種物質(zhì)的多路技術(shù)?？梢栽O(shè)計可逆和不可 逆?zhèn)鞲衅饕詽M足不同需要，并且連續(xù)監(jiān)控特定目的生物標志是可行的。
[0148] 適當?shù)?，用于檢測本發(fā)明的一種或多種生物標志的生物傳感器組合生物分子識別 與適當方法，以將樣品中的生物標志的存在或定量的檢測轉(zhuǎn)換成信號。生物傳感器可以適 于"備選場地"診斷測試，例如在病室、個體外科室（outsubjects' department)、手術(shù)、家 庭、野外和工作場所中。
[0149] 檢測本發(fā)明的一種或多種生物標志的生物傳感器包括聲學(xué)、等離子共振、全息、生 物層干涉測量法（BLI)和微工程傳感器。印刷的識別元件、薄膜晶體管技術(shù)、磁聲波諧振器 裝置及其他新的聲電系統(tǒng)可以用于傳感器中，用于檢測本發(fā)明的一種或多種生物標志。
[0150] 涉及本發(fā)明的一種或多種生物標志的鑒定和/或定量的方法可以在臺式儀器上 進行，或可以并入一次性使用的診斷或監(jiān)控平臺上，其可以用于非實驗室環(huán)境中，例如醫(yī)生 的辦公室中或在個體的床邊。用于進行本發(fā)明的方法的合適生物傳感器包括具有光或聲閱 讀器的"信用（credit)"卡。生物傳感器可以配置為允許收集數(shù)據(jù)以電子傳輸給醫(yī)生用于 解釋，并且因此可以形成電子醫(yī)學(xué)（e-medicine)的基礎(chǔ)。
[0151] 在本文中描述了用于疾病狀態(tài)的存在的診斷和監(jiān)控的診斷試劑盒。在一個實施方 案中，試劑盒另外含有能夠鑒定和/或定量生物標志的生物傳感器。適當?shù)?，根?jù)本發(fā)明的 試劑盒可以含有選自下述的一種或多種組分：對于生物標志或生物標志的結(jié)構(gòu)/形狀模擬 物特異性的配體結(jié)合劑或配體，一種或多種對照，一種或多種試劑和一種或多種消耗品；任 選連同依照本文定義的任何方法的試劑盒的使用說明書。
[0152] 用于疾病狀態(tài)的生物標志的鑒定允許整合診斷程序和治療方案。本發(fā)明的生物標 志的檢測可以用于在其參與臨床試驗之前篩選個體。生物標志提供指示治療應(yīng)答、未能應(yīng) 答、不利的副作用概況、用藥順應(yīng)程度和足夠的血清藥物水平的實現(xiàn)的方法。生物標志可以 用于提供不利藥物應(yīng)答的警告。生物標志可用于開發(fā)個人化治療，因為應(yīng)答的評價可以用 于細調(diào)劑量，使開出的用藥數(shù)目降到最低，降低獲得有效治療中的延遲且避免不利的藥物 反應(yīng)。因此，通過監(jiān)控本發(fā)明的生物標志，個體護理可以精確地量身定制，以匹配由病癥和 個體的藥物基因組概況確定的需要，生物標志因此可以用于滴定最優(yōu)劑量，預(yù)測陽性治療 應(yīng)答且鑒定處于嚴重副作用的高風(fēng)險中的那些個體。
[0153] 基于生物標志的測試提供'新'個體的第一線評價，并且提供使用目前測量無法實 現(xiàn)的準確且快速診斷的客觀測量。
[0154] 此外，診斷生物標志測試可用于鑒定患有輕度的或無癥狀疾病，或可能處于發(fā)生 有癥狀疾病的高風(fēng)險中的家庭成員或個體。這允許起始適當治療，或預(yù)防措施，例如管理危 險因素。這些方法公認改進結(jié)果且可能預(yù)防病癥的明顯發(fā)作。
[0155] 生物標志監(jiān)控方法、生物傳感器和試劑盒作為個體監(jiān)控工具也是極其重要的，以 使得醫(yī)生能夠確定復(fù)發(fā)是否是由于病癥的惡化。如果藥理學(xué)治療被評價為不充分的，則治 療可以恢復(fù)或增加；如果適當，則可以給予治療中的改變。因為生物標志對病癥的狀態(tài)敏 感，所以它們提供藥物治療影響的指示。
[0156] 本發(fā)明現(xiàn)在將參考下述非限制性實施例進行舉例說明。
[0157] 實施例1 從5個健康個體、3個患有結(jié)腸癌的個體、6個患有肺癌的個體和2個患有胰腺癌的個 體獲得血清樣品。在馬血清中系列稀釋通過由Hela細胞提取的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的商購可 得的核小體制劑，其中核小體中的DNA和蛋白質(zhì)是交聯(lián)的用于穩(wěn)定性。根據(jù)Holdenrieder 的方法（*Holdenrieder等人；2001)制備人血中的核小體制劑。這些樣品和制劑通過本發(fā) 明的方法對于核小體-EZH2加合物一式兩份地進行測定。生產(chǎn)用于組織培養(yǎng)的商購可得的 純馬血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對照樣品進行測定。
[0158] ELISA方法如下使用結(jié)合完整核小體的固相抗組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克 隆抗EZH2檢測抗體：將在0. 1M磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中的抗組蛋白抗體溶液加入微量滴定 孔（100 μ?7孔）中，并且在4°C下溫育過夜，以用捕獲抗體包被孔。傾倒過量的抗組蛋白抗 體。將牛血清白蛋白溶液（20g/L)加入孔（200 μ?7孔)中，并且在室溫下溫育30分鐘，以封 閉孔上的過量蛋白質(zhì)結(jié)合位點。傾倒過量牛血清白蛋白溶液，并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?ν孔，含有1% Tween 20的0. 05Μ TRIS/HC1緩沖液pH 7. 5)洗滌三次。將血清樣品（10 μ?ν 孔）和測定緩沖液（50 μ?7孔，含有0. 9% NaCl、0. 05%脫氧膽酸鈉和1% Nonidet Ρ40代用品 的0. 05M TRIS/HC1 pH 7. 5)加入在4°C下溫育過夜的孔中。傾倒血清和測定緩沖液混合物， 并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入生物素化的抗EZH2檢測抗體溶液（50 μ?ν孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育90分鐘。傾倒過量檢測抗體，并且再次將孔用洗 滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入含有鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物的 溶液（50 μ?7孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育30分鐘。傾倒過量綴合物，并且再次將孔 用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入有色底物溶液（100 μ?7孔，2, 2' -連氮雙[3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育20分鐘。使用標準微 量滴定板閱讀器，在405nm的波長處測量孔的光密度（0D)。觀察到隨著核小體-ΕΖΗ2加合 物濃度增加而增加顏色的劑量應(yīng)答曲線，其中在不存在核小體加合物的情況下（馬血清）觀 察到低本底信號。陽性ELISA信號指示通過ELISA檢測到的EZH2摻入包含組蛋白和EZH2 的核小體-EZH2加合物內(nèi)，因為（i )捕獲抗體結(jié)合樣品中的組蛋白，和（ii )檢測抗體結(jié)合加 合物的EZH2組分。結(jié)果顯示于圖1和2中。
[0159] 實施例2 從5個健康個體、3個患有結(jié)腸癌的個體、6個患有肺癌的個體和2個患有胰腺癌的個 體獲得血清樣品。在馬血清中系列稀釋通過由Hela細胞提取的染色質(zhì)消化產(chǎn)生的商購可 得的核小體制劑。根據(jù)Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等人；2001)制備人血中的核 小體制劑。這些樣品和制劑通過本發(fā)明的方法對于核小體-HMGB1加合物一式兩份地進行 測定。純馬血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對照樣品進行測定。
[0160] ELISA方法如下使用結(jié)合完整核小體的固相抗組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克 隆抗HMGB1檢測抗體：將在0. 1M磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中的抗組蛋白抗體溶液加入微量滴定 孔（100 μ?7孔)中，并且在4°C下溫育過夜，以用捕獲抗體包被孔。傾倒過量抗組蛋白抗體。 將牛血清白蛋白溶液（20g/L)加入孔（200 μ?7孔）中，并且在室溫下溫育30分鐘，以封閉 孔上的過量的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。傾倒過量牛血清白蛋白溶液，并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔，含有1% Tween 20的0. 05M TRIS/HC1緩沖液pH 7. 5)洗滌三次。將血清樣品（10 μ?7 孔）和測定緩沖液（50 μ?7孔，含有0. 9% NaCl、0. 05%脫氧膽酸鈉和1% Nonidet Ρ40代用品 的0. 05M TRIS/HC1 pH 7. 5)加入在4°C下溫育過夜的孔中。傾倒血清和測定緩沖液混合物， 并且將孔用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入生物素化的抗HMGB1檢測抗體溶液（50 μ?ν孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育90分鐘。傾倒過量檢測抗體，并且再次將孔用洗 滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入含有鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物的 溶液（50 μ?7孔)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育30分鐘。傾倒過量綴合物，并且再次將孔 用洗滌緩沖液（200 μ?7孔)洗滌三次。加入有色底物溶液（100 μ?7孔，2, 2' -連氮雙[3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽)，并且在室溫下伴隨輕微攪動溫育20分鐘。使用標準微量 滴定板閱讀器，在405nm的波長處測量孔的光密度（0D)。觀察到隨著核小體-HMGB1加合物 濃度增加而增加顏色的劑量應(yīng)答曲線，其中在不存在核小體加合物的情況下(馬血清）觀察 到低本底信號。陽性ELISA信號指示通過ELISA檢測到的HMGB1摻入包含組蛋白和HMGB1 的核小體-HMGB1加合物中，因為（i )捕獲抗體結(jié)合樣品中的組蛋白，和（i i )檢測抗體結(jié)合 加合物的HMGB1組分。結(jié)果顯示于圖3和4中。
[0161] 在更大型的實驗中，從25位患有結(jié)腸癌的患者、25位患有乳腺癌的患者和24位患 有肺癌的患者獲得血清樣品，以及來自31個健康個體的樣品。樣品就核小體-HMGB1水平 進行測試，使用平均健康結(jié)果加上平均值中的2個標準差作為截止，對于結(jié)腸癌、乳腺癌和 肺癌獲得下述結(jié)果： ?結(jié)腸：檢測到76%的癌癥（25位患者中的19位）和90%特異性(來自31個健康樣品 的3個假陽性）； ?乳腺：檢測到96%的癌癥（25位患者中的24位）和90%特異性(來自31個健康樣品 的3個假陽性）；和 ?肺：檢測到100%的癌癥（24位患者中的24位)和86%特異性(來自28個健康樣品的 4個假陽性）； 其中測量的高于截止水平的核小體-HMGB1加合物水平視為陽性結(jié)果，并且較低水平 視為陰性結(jié)果。結(jié)果顯示于圖5中。
[0162] 核小體-HMGB1加合物水平的測定也以反向形式進行，其中將抗HMGB1抗體包被至 孔作為捕獲抗體，并且使抗核小體抗體生物素化且用作檢測抗體。這種測定形式也成功地 檢測到使用的陽性對照中的核小體-HMGB1加合物（0D405nm=l. 15)，但在馬血清或緩沖液 中則沒有檢測到(兩者〇D406nm=0. 13)。
[0163] 實施例3 使用上文實施例1的方法進行核小體-PR ELISA測定，除了使用的生物素化的抗體定向 結(jié)合孕酮受體（PR)之外。結(jié)果顯示于圖6中。
[0164] 實施例4 使用使用上文實施例1的方法進行的核小體-AR加合物ELISA測定，除了使用的生物 素化的抗體定向結(jié)合雄激素受體（AR)之外，測定得自兩個前列腺癌癥患者的血清樣品以及 陽性和陰性對照。結(jié)果顯示于圖7中。
[0165] 實施例5 通過上又實施例1的萬法，除了使用的生物素化的抗體足向結(jié)合α形式的雌激素受 體（ERa )之外，使用通過*Holdenrieder等人；2001的方法制備的核小體樣品進行核小 體-ERa加合物ELISA測定。結(jié)果顯示于圖8中。
[0166] 實施例6 通過由MCF7細胞提取的染色質(zhì)消化制備核小體樣品，并且通過ELISA測定核小 體_ERi3加合物。測定通過類似于上文實施例1的方法的方法進行，除了測定使用不同的抗 核小體抗體和定向結(jié)合β形式的雌激素受體（ERi3)的抗體進行之外。該測定以兩種不同 形式進行。在第一形式中，將抗核小體抗體包被到孔上，并且使抗ERi3抗體生物素化。在 第二形式中，將抗ER0抗體包被到孔上，并且使抗核小體抗體生物素化。在兩種形式中測 定均是成功的。有趣的是，測定看起來在如通常在ChIP法中完成的MCF7染色質(zhì)交聯(lián)時表 現(xiàn)不那么好。結(jié)果顯示于圖9中。
[0167] 實施例7 通過上文實施例6的方法，使用通過*Holdenrieder等人；2001的方法制備的核小體 樣品進行核小體H2AZ-ERi3加合物ELISA測定，其中將抗ERi3抗體包被到孔上，除了使用 的生物素化的抗體定向結(jié)合組蛋白變體H2AZ，使得僅檢測含有H2AZ的核小體-ER β加合物 子集之外。使用該方法，其中核小體或核小體組分結(jié)合劑定向結(jié)合特定表觀遺傳信號結(jié)構(gòu)， 能夠檢測僅含有該表觀遺傳信號的特定核小體加合物子集。結(jié)果顯示于圖10中。
[0168] 實施例8 從12個健康個體、3個患有結(jié)腸癌的個體、6個患有乳腺癌的個體、3個患有肺癌的個 體和4個患有胰腺癌的個體獲得血清樣品。根據(jù)Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等 人；2001)制備人血中的核小體制劑并在馬血清中連續(xù)稀釋。這些樣品和制劑通過本發(fā)明 的方法對核小體-ER3加合物一式兩份地進行測定。生產(chǎn)用于組織培養(yǎng)的商購可得的純馬 血清也作為不含核小體或核小體加合物的陰性對照樣品進行測定。測定使用上文實施例1 的方法進行，除了使用的檢測抗體針對雌激素受體（ERi3 )之外。使用計算為平均健康結(jié)果 加上平均值的2個標準差的截止，3個結(jié)腸癌樣品中的2個、6個乳腺癌樣品中的3個、3個 肺癌樣品中的2個和4個胰腺癌樣品中的4個對于核小體-ERi3加合物發(fā)現(xiàn)是陽性的。結(jié) 果顯示于圖11中。
[0169] 實施例9 使用上文實施例6的方法進行核小體-雌激素受體-類固醇雌激素 ELISA測定，除了 使用的檢測抗體針對類固醇雌激素之外。該測定因此僅檢測另外含有類固醇激素的核小 體-雌激素受體加合物。
[0170] 實施例10 使用類似于上文實施例的方法進行核小體-雌激素受體-雌激素加合物ELISA測定， 除了下述之外：測定在對有機溶劑是抗性的微量滴定板或管中進行，在抗核小體抗體在孔 表面上捕獲核小體-雌激素受體加合物后，傾倒孔的液體內(nèi)含物，并且加入二乙醚以溶解 捕獲的加合物中存在的任何類固醇。將醚轉(zhuǎn)移至另一個孔或管并干燥。將干燥提取物再 溶解于測定緩沖液中，并且使用用于雌激素分析的經(jīng)典競爭性免疫測定方法測定雌激素濃 度。該測定因此僅檢測另外含有雌激素的核小體-雌激素受體加合物。
[0171] 實施例11 使用上文實施例10的萬法進彳丁核小體-視黃酸受體-視黃酸ELISA測足，除了使用的 類固醇競爭性免疫測定針對視黃酸之外。該測定因此僅檢測另外含有類固醇視黃酸的核小 體-視黃酸受體加合物。
[0172] 實施例12 進行類似于實施例1-10中所述的那些核小體加合物測定，除了使用的固相包被抗體 針對5-甲基胞苷之外。這些測定因此僅檢測核小體-激素受體加合物和另外與甲基化DNA 相關(guān)的核小體-激素受體-激素復(fù)合加合物。
[0173] 參考文獻 Allen 等人4 A simple method for estimating global DNA methylation using tjisulfile PCR of repetitive DNA eiemenls^ Nucleic Acids Research: 32(3) e38DOI: 10^1093/nar/gnh032, 2004 Bawden A., Detection of histone modification in ceil-free nucleosomes^ WO 2005/019826, 2005 Cao tf Λ. Rote of Histone H3 Lysine 27 Methylaiion in Polycomb-Group Silencing SCIENCE 298, 1039-1043, 2002 Dai'*$ 人，Detedicm erf Post-translattonal Modifications on Native iniact Nucleosornes by ELISA^ http://wwwj〇￥exom/delaits^php?id=2593 doi; 10 3791/2593 J Vis Exp 50 (2011) Esleller, Cancer epigeoomics; DNA methylomes and Nslooe-modificalion maps Nature Reviews Genetics: 8, 286-298. 2007 Feinberg |ti Vogelstein, Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature: 301, 89-92, 1983 ful!grabe,'| 4,Histoneonco-modifications^ Oncogene: 30, 3391-3403, 2011 Gertiiz ^f'A.The dynamics of HMG protein-chromatin interactions in living ceils. Biochem Cel! BioL 8?. 127-137. 2009 Gartzmann $人，Sensitive Detection of Cotoreetal Cancer in Peripheral Blood by Septn 9 DNA Methylation Assay PLoS ONE 3(11): e3759-doi: 10,1371 /journa I ^ pone.0003T59, 2008 Herranz |il Esteiler, DNA methylation and histone modifications in subjects wiih cancer; potential prognostic and therapeutic iargets^ Methods Mol Biol,361:25-62, 2007 Hervouetl 人，Disruption of Dr?mt1/PCNA/LfHRF*Unteractions Promotes Tumorigenesis from Human and Mice Glial Celts PLoS ONE 5(8}: e11333. doi: 10.1371/journal pone.0011333, 2010 Holdenfieder *5:人，Nudeosomes in serum of subjecls wtth benign and malignant diseases. Ini J. Cancer (Pred Oncol.}; 95, 114-120, 2001 ?HoWenrieder 等人，Nucleosornes in Serum as a Marker for Cell Death, CBn Chem Lab Mecf. 39(7). 596-605. 2001 Hoidenfieder-? A. Cell-Free DNA in Serum and Plasma: Comparison of ELISA and Quantitative PCR. Clinical Chemistnsf： 51(8). 1544-1546,2--5 Holdenrieder Slieber, Clinical use of circulating nudeosomes. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences; 46(1); 1-24? 2009 Ricte fll B?etmsky, Easy detection of chromatin bindirtg proteins bf the histone association assay. Biol Proced Online, 7(1). 60-69.2005 Rodfiguez-Paredes |I! Esteller, Cancer epigenetics reaches mainstream oncology^ Nature Medicine: 17(3), 330-339, 2011 Salgamelf Λ?Αη EUSA for defection of apoptosis, Nucleic Acids Research, 25(3), 680-681. 1997 Sims 1 人，HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer. Amu, Ret Immunol. 28, 367-338, 2010 Stoetzer^f A., Circulating nucteosomes and biomarkers of immunogerifc cel! death as predictwe and prognostic markers in cancer patients undergoing cytotoxic therapy. Expert Opin Biol Ther. 12(Suppl. 1): S217-S224, 2012 Tang If 人，High-mobity Group Box 1 [HMGB1] and Cancer- Biochim BSophys Ada 17990-2) 131, 2010 Urbonaviciijte 人，Induction erf inflammatory and immune responses by HMGB1 - nucleosome complexes: implications for the pathogenesis of SLE J Exp Med, 205<13》，3007-3018, 2008 Urbonavidute fll Voll, High-mobility group box 1 represents a potential marker of disease and novel therapeutic target in systemic lupus erythematosus. J Internal Medicine, 270, 309-318, 2011 van Mieuwenhu_人.Time between onset oi apoptosis and release of nudeosomes from apoptotic cells: putative implications for sysytemic lupus eiythemalosus, Ann Rheum Dis; 62; 10-14, 2003 Yoshida fll Shimura, Isolation of norrtston? chromosomal protein from calf thymus^ Bioctiirriica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure; 263(3), 690-695, 1972
【權(quán)利要求】
1. 核小體-蛋白質(zhì)加合物作為血液中的生物標志用于診斷癌癥、自身免疫疾病或炎性 疾病的用途。
2. 如權(quán)利要求1中限定的用途，其中所述生物標志用于診斷癌癥。
3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中限定的用途，其中所述核小體-蛋白質(zhì)加合物包括染 色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。
4. 如權(quán)利要求2中限定的用途，其中所述核小體-蛋白質(zhì)加合物包括高速泳動族蛋白。
5. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述染色質(zhì)修飾酶是組蛋白乙?；⑷ヒ阴；⒓?基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、蘇素化、去蘇素化或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 酶。
6. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述核受體是雌激素受體、雄激素受體、孕酮受 體、甲狀腺激素受體、糖皮質(zhì)激素受體或視黃酸受體。
7. 如權(quán)利要求3中限定的用途，其中所述激素是甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素或類固醇激 素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮質(zhì)類固醇或視黃酸。
8. 用于檢測樣品中核小體-蛋白質(zhì)加合物的存在的方法，其包括下述步驟： (i) 使所述樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組分； (ii) 使所述核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合 的蛋白質(zhì)； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與所述樣品中的加合的蛋白質(zhì)的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為所述樣品中核小體加合物的存在的量度。
9. 用于檢測樣品中核小體加合物的存在的方法，其包括下述步驟： (i) 使樣品與第一結(jié)合試劑接觸，所述第一結(jié)合試劑結(jié)合與核小體加合的蛋白質(zhì)； (ii) 使所述核小體或樣品與第二結(jié)合試劑接觸，所述第二結(jié)合試劑結(jié)合核小體或其組 分； (iii) 檢測或定量所述第二結(jié)合試劑與所述樣品中的核小體或其組分的結(jié)合；和 (iv) 使用此類結(jié)合的存在或程度作為所述樣品中核小體加合物的存在的量度。
10. 如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9中限定的方法，其中所述核小體加合物包括促炎蛋白、 高速泳動族蛋白、多梳蛋白、染色質(zhì)修飾酶、核受體或激素。
11. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述高速泳動族蛋白是HMGB1。
12. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述染色質(zhì)修飾酶是EZH2。
13. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述激素受體是雌激素受體、雄激素受體、孕酮 受體、甲狀腺激素受體或視黃酸受體。
14. 如權(quán)利要求10中限定的方法，其中所述激素是甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素或類固醇 激素，包括雌激素、雄激素、孕激素或視黃酸。
15. 如權(quán)利要求8-14中任一項中限定的方法，其中所述核小體或核小體組分結(jié)合劑定 向結(jié)合特定表觀遺傳信號結(jié)構(gòu)，使得僅檢測含有所述表觀遺傳信號結(jié)構(gòu)的核小體加合物的 特定子集。
16. 如權(quán)利要求8-15中任一項中限定的方法，其中所述結(jié)合試劑是抗體、抗體片段或 適體。
17. 如權(quán)利要求8-16中任一項中限定的方法，其中所述樣品是生物流體。
18. 如權(quán)利要求8-17中任一項中限足的萬法，其中所述樣品是血液或血清或血漿。
19. 如權(quán)利要求8-18中任一項中限定的用于檢測細胞中的核小體-蛋白質(zhì)加合物的存 在的方法，其包括下述步驟： (i) 從細胞中分離染色質(zhì)； (ii) 消化、超聲處理或以其他方式分解所述染色質(zhì)，以形成單核小體和/或寡核小體； 和 (iii) 如權(quán)利要求8-18中任一項的方法中限定的，檢測或測量所述核小體加合物的存 在。
20. 用于檢測或診斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測或測量個體的體液中的核 小體加合物；和 (ii)使用檢測到的所述核小體加合物水平來鑒定所述個體的疾病狀態(tài)。
21. 用于評價動物或人個體對醫(yī)學(xué)治療的適合性的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測或測量所述個體的體液中 的核小體加合物；和 (ii)使用檢測到的所述核小體加合物水平作為選擇所述個體的合適治療的參數(shù)。
22. 用于監(jiān)控動物或人個體的治療的方法，其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測或測量所述個體的體液中 的核小體加合物； (ii) 在一個或多個場合重復(fù)所述個體的體液中的核小體加合物的檢測或測量； (iii) 使用檢測到的所述核小體加合物水平中的任何改變作為所述個體的狀況中的任 何改變的參數(shù)。
23. 如權(quán)利要求20-22中任一項中限定的方法，其中檢測或測量所述核小體加合物作 為一組測量之一。
24. 如權(quán)利要求20-23中任一項中限定的方法，其用于在患有實際或可疑癌癥、良性腫 瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、傳染病、膿毒癥、中風(fēng)或心肌梗塞的個體中。
25. 如權(quán)利要求8-24中任一項中限定的方法，其用于檢測激素-激素受體-核小體復(fù) 合加合物。
26. 如權(quán)利要求25中限定的方法，其中所述激素-激素受體-核小體復(fù)合加合物包含 甲狀腺素-甲狀腺激素受體-核小體復(fù)合加合物、三碘甲狀腺原氨酸-甲狀腺激素受體-核 小體復(fù)合加合物、視黃酸-視黃酸受體-核小體復(fù)合加合物、雄激素-雄激素受體-核小體 復(fù)合加合物或雌激素-雌激素受體-核小體復(fù)合加合物。
27. 如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26中限定的方法，其包括定向結(jié)合所述激素的抗體或其 他結(jié)合劑。
28. 如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26中限定的方法，其包括從抗體捕獲的激素-激素受 體-核小體復(fù)合加合物中提取所述激素的步驟，隨后為定量步驟。
29. 鑒定核小體加合物生物標志用于檢測或診斷動物或人個體中的疾病狀態(tài)的方法， 其包括下述步驟： (i )如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法的任一種限定的，檢測或測量所述個體的體液中 的核小體加合物； (ii) 檢測或測量健康個體或?qū)φ諅€體的體液中的核小體加合物；和 (iii) 使用在患病和對照個體中檢測到的水平之間的差異，來鑒定核小體加合物是否 可用作所述疾病狀態(tài)的生物標志。
30. 生物標志，其由如權(quán)利要求29中限定的方法鑒定。
31. 用于檢測核小體加合物的試劑盒，其包括對于所述加合物或其組成部分中的蛋白 質(zhì)、或所述加合物或其組成部分中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異性的配體或結(jié)合劑， 連同依照權(quán)利要求3-28中限定的任何一種方法的所述試劑盒的使用說明書。
【文檔編號】G01N33/574GK104067125SQ201280060149
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月7日
【發(fā)明者】J.V.米卡萊夫, M.E.?？巳R斯頓, M.赫佐格 申請人:新加坡意志私人有限公司