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基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素a的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于熒光染料四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，簡稱TMR）標記的核酸適配體熒光各向異性（熒光偏振）檢測赭曲霉素A的方法，本發(fā)明將TMR修飾到赭曲霉素A適配體的特定位置上，赭曲霉素A的結合引起TMR標記的核酸適配體熒光各向異性（熒光偏振）值發(fā)生明顯改變，通過測定熒光各向異性（熒光偏振）值，可以實現(xiàn)對赭曲霉素A的定量檢測。本發(fā)明具有操作簡單、快速、易于高通量檢測、特異性好、靈敏度高、成本低的優(yōu)點。
【專利說明】基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及真菌毒素檢測技術，具體屬于ー種基于核酸適配體檢測赭曲霉素A的熒光檢測技木。
【背景技術】
[0002]赭曲霉素A,英文名稱為Ochratoxin A,是ー種影響廣泛的真菌毒素，曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)毒菌包括赭曲霉、疣孢青霉和碳黑曲霉等。赭曲霉素A可以直接污染谷類、飼料、水果、干果等農(nóng)作物和多種食品，人和動物通過攝入污染的植物性食物而吸收進入體內(nèi)，同時也可因赭曲霉素A在動物體內(nèi)的蓄積作用而通過攝入動物性食物進入人體內(nèi)。赭曲霉素A具有很強的腎臟毒性、免疫抑制毒性、神經(jīng)毒性、致癌性、致畸性。高靈敏、高特異檢測赭曲霉素在食品安全和環(huán)境健康方面具有重要的意義。檢測方法目前主要包括薄層色譜、高效液相色譜、酶聯(lián)免疫分析、液質(zhì)聯(lián)用等方法。這些方法往往需要昂貴的儀器和復雜的操作步驟。采用免疫抗體的分析方法需要利用特異性識別赭曲霉素A的抗體，抗體的制備往往成本高，制備重現(xiàn)性差，穩(wěn)定性好，抗體保存和運輸?shù)臈l件要求高。
[0003]核酸適配體(Aptamer)是通過SELEX技術篩選出的ー類能與目標分子特異性結合的寡聚核苷酸片段，對目標分子具有高度親和カ和專ー性的識別能力(Ellington, A.D.and Szostak, J.ff.Naturel990, 346, 818 - 822.Tuerk, C.and Gold, L.Sciencel990, 249，505 - 510.)。核酸適配體作為親和配體，與免疫抗體相比，具有顯著的優(yōu)點:具有高的親和カ和高特異性；篩選制備方便；穩(wěn)定性高；易于化學修飾。因此核酸適配體在分析檢測和傳感領域中顯示出很多優(yōu)點，可以克服常用的免疫抗體的在穩(wěn)定性和制備等的ー些局限，顯示出應用前景(Liu, J.;Cao, Z.;Lu, Y.Chem.Rev.2009，109，1948 -1998 ; Cho, E.J.; Lee, J.-ff.; Ellington, A.D.Annu.Rev.Anal.Chem.2009, 2, 241 - 264.) ? 已報道的利用核酸適配體檢測赭曲霉素A的方法往往比較復雜，需要采用合理的設計和分離等，如電化學傳感、親和色譜等(Yang, X.H.; Kong, ff.J.; Yang, M.H.; Zhao, M.; Ouyang, Z.Chin.J.Anal.Chem.2013, 41, 2977306 ;Hayat，A.; Paniel, N.; Rhouati, A.; Marty, J.-L? ;Barthelmebs, L.Food Control2012, 26, 401 - 415 ;Chapuis-Hugon, F.;duBoisbaudry, A.; Madru, B.;Pichon, V.Anal.Bioanal.Chem.2011, 400, 1199 - 1207.)。
[0004]本發(fā)明采用突光染料四甲基羅丹明(tetramethyIrhodamine,簡稱TMR)標記的核酸適配體建立了一種簡單方便的熒光各向異性(熒光偏振)法檢測赭曲霉素A的檢測技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法和相應的試劑，該方法具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明是利用赭曲霉素A與四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine,簡稱TMR)修飾的核酸適配體的選擇性結合，引起TMR修飾的核酸適配體的熒光各向異性(熒光偏振)改變，通過測定熒光各向異性(熒光偏振)的變化，實現(xiàn)對赭曲霉素A的定量檢測。(見圖1)。
[0007]本發(fā)明提供的一種突光染料四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine,簡稱TMR)標記的核酸適配體，其核酸適配體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1 (5’ -GAT CGG GTG TGG GTGGCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’);TMR標記到核苷酸序列SEQ ID NO:1的5，端開始的第10個T堿基上，或第8個T堿基上，或第19個T堿基上。
[0008]本發(fā)明提供的一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，步驟包括:將TMR標記的核酸適配體，在結合緩沖溶液中與赭曲霉素A混合，溫育，測定TMR標記的核酸適配體的熒光各向異性，激發(fā)波長為560納米，發(fā)射波長為578納米，依據(jù)核酸適配體的熒光各向異性的變化，即可求得被測樣品中赭曲霉素A的濃度。
[0009]所述的結合緩沖溶液為:IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20,pH8.50
[0010]與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明具有如下的優(yōu)點和效果:
[0011]本發(fā)明將熒光染料標記的核酸適配體用于對赭曲霉素A的特異性識別，充分利用核酸適配體的高穩(wěn)定性、易制備、易引入功能團等方面的優(yōu)點。熒光各向異性(熒光偏振)檢測技術具有操作簡單、靈敏、重現(xiàn)性好、無需分離、易實現(xiàn)高通量分析等優(yōu)點。本發(fā)明只需要采用ー種熒光染料標記的適配體和相應的結合緩沖溶液，整個檢測過程簡単，容易操作，并不要求復雜的儀器設備。本發(fā)明采用核酸適配體作為識別試劑可以克服使用免疫抗體在制備和穩(wěn)定性等方面的局限性。便于快速處理大批量樣品，易于商品化和實際應用，具有高通量、自動化分析的優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0012]圖1采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測不同濃度的赭曲霉素A
[0013]圖2采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測赭曲霉素A的選擇性。
[0014]圖3采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測在采用緩沖溶液50倍稀釋的葡萄酒中不同濃度的赭曲霉素A
【具體實施方式】:
[0015]實施例1:采用第10個T堿基上標記TMR的核酸適配體檢測不同濃度的赭曲霉素A (圖1)。
[0016]TMR標記的核酸適配體具有如下序列:5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAGCAT CGG ACA-3，TMR被標記到第10個T堿基上，相應的TMR標記的核酸適配體簡稱為T10-TMR-036。
[0017]在緩沖溶液(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20, pH8.5)中將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同濃度的赭曲霉素A混合，在室溫下溫育40分鐘，然后測定T10-TMR-036的熒光各向異性，激發(fā)光波長560納米，發(fā)射光波長578納米。隨著赭曲霉素A (Ochratoxin A)的濃度的增加，T10-TMR-036的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為3nM，檢測范圍3nM到3 y M，檢測相對標準偏差小于3%。
[0018]實施例2:考察基于TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測赭曲霉素A的選擇性(圖2)。[0019]在緩沖溶液中(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20,pH8.5)將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同的待測物混合，室溫下溫育40分鐘，測定T10-TMR-036的熒光各向異性變化Ar。只有赭曲霉素A (620nM)引起T10-TMR-036的熒光各向異性值的顯著降低，其它被測物質(zhì)均不能引起T10-TMR-036的熒光各向異性值的顯著變化。圖2中(a)為不含有赭曲霉素A的緩沖溶液，(b)為620nM赭曲霉素 A,由(C)到(j)被測物質(zhì)分別為 10 u M N-acetyl-L-phenylalanine (NAP) (c), 7 U Mwarfarin(d),9 u M7-amino-4-methylcoumarin (AMC) (e；,62 u M arginine(t；, 62 u Mphenylalanine(g)，62u M aspartic acid(h),62 U M serine(i),62 U M tyrosine リノ。
[0020]實施例3:采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)在稀釋的紅葡萄酒中檢測赭曲霉素A (圖3)。
[0021]將紅葡萄酒采用緩沖溶液(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mMCaC12, 0.l%Tween20, pH8.5)稀釋50倍，然后在稀釋的紅葡萄酒溶液中將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同濃度的赭曲霉素A混合，在室溫下溫育40分鐘，然后測定T10-TMR-036的突光各向異性，激發(fā)光波長560納米,發(fā)射光波長578納米。隨著赭曲霉素A (OchratoxinA)的濃度的增加，T10-TMR-036的熒光各向異性值r逐漸降低。
【權利要求】
1.一種熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體，其特征在于，所述的核酸適配體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ;熒光染料四甲基羅丹明標記到核苷酸序列SEQ ID NO:1的5’端開始的第10個T堿基上，或第8個T堿基上，或第19個T堿基上。
2.一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，步驟包括:將權利要求1所述的熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體，在結合緩沖溶液中與赭曲霉素A混合，溫育，測定熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體的熒光各向異性，激發(fā)波長為560納米，發(fā)射波長為578納米，依據(jù)核酸適配體的熒光各向異性的變化，求得被測樣品中赭曲霉素A的濃度。
3.如權利要求2所述的ー種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，所述的結合緩沖溶液為:10mM Tris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20, pH8.5。
【文檔編號】G01N21/64GK103575713SQ201310533285
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權日:2013年11月1日
【發(fā)明者】趙強, 呂琴 申請人:山西大學