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一種檢測l-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。首先，在鏈霉親和素(streptavidin，SA)修飾的磁珠(magneticheads，MBs)上固定生物素(biotin)修飾的單鏈DNA1，得到DNA1-MBs復(fù)合物。另外，用DNA2和轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金，得DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金。再把DNA1-MBs和DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金混合，得到L-組氨酸傳感器。再將一定量的L-組氨酸加入所制備的L-組氨酸傳感器中反應(yīng)一段時間，通過磁性分離，取上清液并加入蔗糖，反應(yīng)一段時間，轉(zhuǎn)化酶把蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，直接用血糖儀檢測生成的葡萄糖，通過檢測葡萄糖的含量來檢測L-組氨酸的含量。本發(fā)明的傳感器具有高的靈敏度、選擇性；以血糖儀為檢測儀器和磁珠為載體，操作簡單，檢測儀器體積小、價格便宜、方便攜帶。
【專利說明】一種檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)和生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種檢測L-組氨酸生物傳 感器的制備方法及其應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及所述的生物傳感器檢測L-組氨酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] L-組氨酸（L-Histidine，L-His)作為一個神經(jīng)傳遞介質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)在哺乳動物 的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，研究表明其在生物的重要基底里支配金屬的傳輸和減小 微小創(chuàng)傷的內(nèi)部流血；過多L-組氨酸的攝取能導(dǎo)致中毒，生物體內(nèi)L-組氨酸濃度的變化會 導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，因此，對L-組氨酸的檢測將是非常重要的。
[0003] 近年來L-組氨酸測定方法主要有：電化學(xué)法（Junfei Liang, Zhengbo Chen, Lin Guo and Li dong Li, Chem. Commun.，2011，47, 5476 - 5478);化學(xué)發(fā)光法（Johann Elbaz, Bella Shlyahovsky and Itamar ffillner, Chem. Commun. , 2008, 1569 - 1571)；表 面增強(qiáng)納曼散射法（Sujuan Ye, Yuanyuan Guo, Jie Xiao and Shusheng Zhang, Chem. Commun. , 2013, 49, 3643-3645);突光法（Rongmei Kong, Xiaobing Zhang, Zhuo Chen, Hongmin Meng, Zhi1ing Song, Weihong Tan,Guoli Shen, Ruqin Yu, Anal. Chem. 2011, 83,7603 - 7607 ；Nathalia Braga Amaral, Simon Zuliani,Valerie Gu i eu, Cor i nne Ravelet, Sandrine Perrier, Eric Peyrin, Anal Bioanal Chem(2014)406:1173 - 1179)等。這些方法各有其優(yōu)點(diǎn)，能不同程度的滿足對L-組氨酸的 檢測要求，但方法復(fù)雜，需要貴重的儀器，檢測成本高。所以必須發(fā)展一種方法簡單、成本低 廉的新型檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測L-組氨酸的生物傳感器 的制備方法及應(yīng)用，以及提供一種采用所述的生物傳感器檢測L-組氨酸的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將0· 1?10. 0 μ mol巰基修飾DNA2在TCEP溶液中活化，再加入到lmL轉(zhuǎn)化 酶修飾膠體金（轉(zhuǎn)化酶-膠體金）溶液中，輕微震蕩8?24小時，然后在8000?16000轉(zhuǎn) /分轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，用lmL的PBS洗滌三次，再將沉淀分散于lmL PBS中，得DNA2修飾 轉(zhuǎn)化酶-膠體金，置于4°C下儲存；
[0008] (2)在20?200 μ L鏈霉親和素修飾的磁珠中加入biotin修飾的單鏈DNA1，37°C 下反應(yīng)后，并用PBS洗滌兩次，去除上清液，沉淀分散于lmL PBS緩沖液中，即得DNA1-鏈霉 親和素修飾的磁珠（DNAl-MBs);
[0009] (3)取lmL的DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠，加入lmL的DNA2修飾轉(zhuǎn)化酶-膠體 金，室溫震蕩反應(yīng)，然后磁性分離，并用PBS洗滌3次，得L-組氨酸生物傳感器。
[0010] 其中：所述的轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金按如下的方法制備而成：取10?200 μ L的轉(zhuǎn)化 酶加入裝有l(wèi)mL的膠體金的離心管內(nèi)，在37°C下反應(yīng)10?80分鐘，在8000?16000轉(zhuǎn)/ 分轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，去除未被結(jié)合的酶，再用50 μ L PBS洗滌3次，得轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金 (轉(zhuǎn)化酶-膠體金）；
[0011] 所述的 DNA1 的部分序列為：5' -GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3'
[0012] 所述的 DNA2 的部分序列為：5' -GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3。
[0013] 優(yōu)選地，上述的生物傳感器的制備方法，其中所述的金納米粒子按如下方法制備 而成：先把制備與儲存膠體金溶液所用的玻璃容器（容量瓶，棕色廣口瓶，圓底燒瓶等）用 王水泡洗30分鐘，然后用二次水沖洗干凈，烘干備用。在100mL圓底燒瓶中加入50mLlmmol/ L的HAuC14，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入5mL38. 8mmol/L的Na3C6H507，再加熱10分鐘，攪 拌15分鐘，冷卻至室溫后用0. 8μπι的尼龍膜過濾器過濾，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中于4°C下保存。 用掃描電鏡觀察膠體金的粒徑為20-25nm。
[0014] 一種利用上述方法制備的生物傳感器檢測L-組氨酸含量的方法，使用不同濃度 的L-組氨酸加入L-組氨酸生物傳感器中反應(yīng)后，通過磁性分離，取出上清液。在上清液中 加入10?200μ L的0. 5mM蔗糖溶液，37°C下反應(yīng)30?180分鐘，用血糖儀檢測生成葡萄 糖含量，以血糖儀讀數(shù)（Glucose meters signal)為分析信號，進(jìn)行L-組氨酸的測定。
[0015] 由于上述方法制備的生物傳感器可以檢測L-組氨酸，因此，本發(fā)明提供了上述的 生物傳感器在檢測L-組氨酸含量中的應(yīng)用。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著地進(jìn)步：金納米 粒子提供相對大的比表面積用于負(fù)載轉(zhuǎn)化酶，使得本發(fā)明設(shè)計的生物傳感器具有高靈敏 度。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)血糖儀讀數(shù)（圖6)可以看出，當(dāng)本發(fā)明的生物傳感器用于檢測L-甘氨 酸，L-酪氨酸，L-精氨酸，賴氨酸和D-組氨酸時，其血糖儀讀數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測L-組氨酸的 血糖儀讀數(shù)，這說明該生物傳感器具有很高的選擇性來檢測L-組氨酸。其次，以血糖儀為 檢測儀器，操作簡單、能夠及時快速的提供定量的結(jié)果，檢測儀器體積小、價格便宜，方便攜 帶。再者，以磁珠為載體可以很容易實(shí)現(xiàn)分離和洗滌，操作簡單、方便。因此，本發(fā)明涉及的 生物傳感器在構(gòu)建檢測蛋白質(zhì)的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為檢測L-組氨酸的實(shí)驗(yàn)原理圖。
[0018] 圖2為DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量對信號強(qiáng)度的影響。橫坐標(biāo)為DNA2-轉(zhuǎn)化酶 修飾膠體金用量（Dose of NDA2-invertase_AuNPs(yL))，縱坐標(biāo)為血糖儀讀數(shù)（Glucose meters signal (mg/dL))
[0019] 圖3為DNA的雜交時間（Hybridization reaction time (min))對信號強(qiáng)度的影響。
[0020] 圖4為L-組氨酸與傳感器孵育時間（Incubation time(min))對信號強(qiáng)度的影響。
[0021] 圖5為L-組氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為L-組氨酸濃度（CVmstidine/nM)。
[0022] 圖6為本發(fā)明的生物傳感器檢測不同物質(zhì)（Sample) L-甘氨酸（L-Gly)，L-酪氨酸 (L-Tyr)，L-精氨酸（L-Arg)，賴氨酸（L-Lys)，D-組氨酸（D-His)和 L-組氨酸（L-His)的 血糖儀讀數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下是本發(fā)明涉及的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但是本發(fā) 明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0024] 本發(fā)明涉及的一種檢測L-組氨酸的生物傳感器，在鏈霉親和素（streptavidin， SA)修飾的磁珠（magneticheads，MBs)上固定生物素（biotin)修飾的單鏈DNA1，通過磁性 分離，再用水洗滌去除多余的DNA1，得到DNAl-MBs復(fù)合物。另外用轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金，得轉(zhuǎn) 化酶-膠體金，再把DNA2修飾在轉(zhuǎn)化酶-膠體金上，離心后，用PBS洗滌，得DNA2-轉(zhuǎn)化酶 修飾膠體金。再把DNAl-MBs和DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金混合，通過DNA1和DNA2雜交作用 一段時間后，再用PBS洗滌，得到L-組氨酸傳感器。
[0025] 利用L-組氨酸傳感器測定L-組氨酸含量：再將一定量的L-組氨酸加入所制備的 L-組氨酸傳感器中，反應(yīng)一段時間，通過磁性分離，取上清液并加入過量的蔗糖，反應(yīng)一段 時間，轉(zhuǎn)化酶把蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，直接用血糖儀檢測生成的葡萄糖，通過檢測葡萄糖的含 量來檢測L-組氨酸的含量。
[0026] 本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：一種檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法， 包括以下步驟：
[0027] (1)利用現(xiàn)有方法，制備出合適粒徑的膠體金；
[0028] (2)利用轉(zhuǎn)化酶與膠體金作用，將轉(zhuǎn)化酶修飾在膠體金表面；
[0029] (3)利用DNA2與轉(zhuǎn)化酶-膠體金作用，將巰基修飾的DNA2修飾到轉(zhuǎn)化酶-膠體金 上；
[0030] (4)利用DNA1與鏈霉親和素修飾的磁珠作用，將DNA1-鏈霉親和素修飾到磁珠上， 得到DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠（DNAl-MBs);
[0031] (5)利用雜交技術(shù)，構(gòu)建生物傳感器。
[0032] 所述的DNA2修飾的轉(zhuǎn)化酶-膠體金、DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠和傳感器的制 備包括以下步驟：
[0033] (1)將3. 0 μ mol巰基修飾DNA2在2 μ LlOmM的TCEP溶液中活化L 5小時，然后加 入到lmL轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金溶液中，輕微震蕩16小時，暗處放置48小時，將其放入離心機(jī) 中在10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，用0. 3mol/L NaCl溶液和lmL的PBS洗滌三次，將沉 淀分散于lmL PBS中得DNA2修飾的轉(zhuǎn)化酶-膠體金，置于4°C下儲存?zhèn)溆谩?br> [0034] (2)在100yL1.2mg/mL的鏈霉親和素修飾的磁珠中加入biotin修飾的單鏈 DNA1，使單鏈DNA1的終濃度是1 μ M，37°C反應(yīng)40分鐘，并用PBS洗漆，去除上清液，沉淀分 散于lmL PBS緩沖液中，即得DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠（DNAl-MBs)。
[0035] (3)取lmL DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠，加入lmL DNA2修飾轉(zhuǎn)化酶-膠體金，室 溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后磁性分離，并用PBS洗滌3次，得L-組氨酸傳感器。
[0036] 具體的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。
[0037] 本發(fā)明的檢測條件，具體特征如下：
[0038] (1)DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看 出，隨著DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量從5增加到40 μ L時，信號強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)DNA2-轉(zhuǎn) 化酶修飾膠體金用量為50 μ L時，信號強(qiáng)度最大。優(yōu)選的，最佳用量為50 μ L。
[0039] (2)DNA的雜交時間。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，反應(yīng)的時間 從20分鐘增加到60分鐘時，信號強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間為70分鐘時，信號強(qiáng)度最大。 優(yōu)選的，最佳雜交時間為70分鐘。
[0040] (3)L-組氨酸與傳感器孵育時間。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看 出，反應(yīng)的時間從10分鐘增加到25分鐘時，信號強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間為30分鐘時， 信號強(qiáng)度最大，隨后信號基本保持不變。優(yōu)選的，最佳孵育時間選定為30分鐘。
[0041] 實(shí)施例：基于DNA雜交技術(shù)的生物傳感器檢測L-組氨酸
[0042] 1.實(shí)驗(yàn)部分
[0043] 1. 1儀器與試劑
[0044] 1. 1. 1 儀器
[0045] 怡成血糖儀（北京怡成生物電子技術(shù)有限公司）、Z_82A氣浴恒溫振蕩器（全壇市 醫(yī)療儀器廠）；Anke-TGL-16C飛翁牌高速離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）。
[0046] 1. 1. 2 試劑
[0047] HAuC14、Na3C6H507、TCEP (三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽）、蔗糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑 有限公司；轉(zhuǎn)化酶購于Sigma ;鏈霉親和素修飾磁珠購自于天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。
[0048] DNA由賽百盛公司合成，序列如下：
[0049] DNA1:5' -GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3'
[0050] DNA2:5 ' -GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3 '
[0051] 磷酸緩沖溶液濃度為0. 2M，磷酸鹽緩沖液組成：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液。
[0052] 本發(fā)明的PBS緩沖溶液為0· 2Μ(ρΗ7· 4)，其配置方法為：稱取0· 2g ΚΗ2Ρ04、8· 0g NaCl、2. 9g Na2HP04 · 12H20 及 0· 2g KC1 溶解于 1L 水中即得。
[0053] 1· 2實(shí)驗(yàn)方法
[0054] 1. 2. 1膠體金制備
[0055] 先把制備與儲存膠體金溶液所用的玻璃容器（容量瓶，棕色廣口瓶，圓底燒瓶等） 用王水泡洗30分鐘，然后用二次水沖洗干凈，烘干備用。
[0056] 在100mL圓底燒瓶中加入50mLlmmol/L的HAuC14，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入 5mL38. 8mmol/L的Na3C6H507，再加熱10分鐘，攪拌15分鐘，冷卻至室溫后用0. 8 μ m的尼龍 膜過濾器過濾，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中于4°C下保存。用掃描電鏡觀察膠體金的粒徑為20-25nm。
[0057] L 2. 2轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金制備
[0058] 取100 μ L的轉(zhuǎn)化酶加入lmL的膠體金離心管內(nèi)，在37°C下反應(yīng)30分鐘，在12000 轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除未被結(jié)合的酶上清液，再用50 μ L PBS洗滌3次，得轉(zhuǎn)化酶修飾膠 體金（轉(zhuǎn)化酶-膠體金）。
[0059] 1. 2. 3DNA2修飾轉(zhuǎn)化酶-膠體金的制備
[0060] 將3. 0 μ mol巰基修飾DNA2在2 μ LlOmM TCEP溶液中活化1. 5小時，然后加入到 lmL轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金溶液中，輕微震蕩16小時，暗處放置48小時，將其放入離心機(jī)中在 10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，用0. 3mol/L NaCl溶液和lmL的PBS洗滌三次，將沉淀分 散于lmL PBS中置于4°C下儲存?zhèn)溆谩?br> [0061] 1. 2. 4DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠制備
[0062] 在100 μ LI. 2mg/mL的鏈霉親和素修飾的磁珠中加入biotin修飾的單鏈DNA1，使 單鏈DNA1的終濃度是1 μ M，37 °C反應(yīng)40分鐘，并用PBS洗滌兩次，去除上清液，沉淀分散于 lmL PBS緩沖液中，即得DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠（DNAl-MBs)。
[0063] 1. 2. 5傳感器的制備
[0064] 取lmL的DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠，加入lmL的DNA2修飾轉(zhuǎn)化酶-膠體金， 室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，然后磁性分離，并用PBS洗滌3次，得傳感器。
[0065] 1. 2. 6L-組氨酸的測定
[0066] 向10 μ L傳感器溶液加入一定濃度的L-組氨酸，37°C反應(yīng)30分鐘，通過磁性分 離，取出上清液。在上清液中加入l〇〇yL的0. 5mM蔗糖溶液，37°C下反應(yīng)2h，用血糖儀檢測 生成葡萄糖含量，根據(jù)血糖儀讀數(shù)和L-組氨酸濃度關(guān)系得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0067] 2.結(jié)果與討論
[0068] 2. 1實(shí)驗(yàn)原理
[0069] 在鏈霉親和素（streptavidin，SA)修飾的磁珠（magneticheads，MBs)上固定生物 素（biotin)修飾的單鏈DNA1 (通過SA-biotin相互作用），通過磁性分離，再用水洗漆去 除多余的DNA1，得到DNAl-MBs復(fù)合物。另外用轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金，再把DNA2修飾在轉(zhuǎn)化 酶-膠體金上，離心后，用PBS洗漆，得DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金。再把DNAl-MBs和DNA2-轉(zhuǎn) 化酶修飾膠體金混合，通過DNA1和DNA2雜交作用一段時間后，再用PBS洗滌，得到L-組氨 酸傳感器（圖1)。再將一定量的L-組氨酸加入所制備的傳感器中，反應(yīng)一段時間，通過磁 性分離，取上清液并加入過量的蔗糖，反應(yīng)一段時間，轉(zhuǎn)化酶把蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，直接用 血糖儀檢測生成的葡萄糖，通過檢測葡萄糖的含量來檢測L-組氨酸的含量。
[0070] 2. 2DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量對信號強(qiáng)度的影響
[0071] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量影響葡萄糖濃度。圖2顯示了 DNA2-轉(zhuǎn) 化酶修飾膠體金用量對信號強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量從5 增加到40 μ L時，信號強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量為50 μ L時，信號強(qiáng) 度最大。因此，DNA2-轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金用量選為50 μ L。
[0072] 2. 3DNA的雜交時間對信號強(qiáng)度的影響
[0073] DNA的雜交孵化時間影響信號強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)的時間從20分鐘增加到 60分鐘時，信號強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間為70分鐘時，信號強(qiáng)度最大（圖3)，故在后續(xù)的 實(shí)驗(yàn)中，孵育時間選定為70分鐘。
[0074] 2. 4L-組氨酸與傳感器孵育時間對信號強(qiáng)度的影響
[0075] L-組氨酸與傳感器孵育時間影響信號強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)的時間從10分鐘 增加到25分鐘時，信號強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間為30分鐘時，信號強(qiáng)度最大（圖4)，隨后 信號基本保持不變。故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，孵育時間選定為30分鐘。
[0076] 2. 5分析參數(shù)及工作曲線
[0077] 在最佳最佳條件下，隨著L-組氨酸濃度的增加，血糖儀的讀數(shù)增大。依本實(shí)驗(yàn) 方法，測定不同濃度的L-組氨酸溶液下血糖儀的讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖5。發(fā) 現(xiàn)L-組氨酸在0. 2?500. ΟηΜ范圍內(nèi)與血糖儀讀數(shù)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y = 0. 719x+5. 339 (X，L-組氨酸濃度，單位：nM，R = 0. 998)，檢出限為0. 08nM。對濃度為25nM 的進(jìn)行7此測定，RSD為3. 9%。
[0078] 2. 6生物傳感器的選擇性
[0079] 同時，考察了該傳感器的選擇性。圖6為本發(fā)明的生物傳感器檢測L-甘氨酸 (L-Gly)，L-酪氨酸（L-Tyr)，L-精氨酸（L-Arg)，賴氨酸（L-Lys)，D-組氨酸（D-His)和 L-組氨酸（L-His)的血糖儀讀數(shù)，從圖6可以看出，檢測L-甘氨酸（L-Gly)，L-酪氨酸 (L-Tyr)，L-精氨酸（L-Arg)，賴氨酸（L-Lys)，D-組氨酸（D-His)讀數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測L-組 氨酸（L-His)的讀數(shù)，說明該生物傳感器檢測L-組氨酸具有很高的選擇性。
[0080] 2. 7實(shí)際樣品中L-組氨酸含量的測定
[0081] 使用建立的方法測定了血液中L-組氨酸的含量。測得的L-組氨酸的濃度如表1 所示。并通過回收實(shí)驗(yàn)考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度，回收率在94. 0% -101. 4%之間。
[0082] 表1實(shí)際樣品中L-組氨酸含量的測定結(jié)果
[0083]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，包括以下步驟： (1) 將0. 1?10. Ο μ mol巰基修飾DNA2在TCEP溶液中活化，再加入到lmL轉(zhuǎn)化酶修飾 膠體金（轉(zhuǎn)化酶-膠體金）溶液中，輕微震蕩8?24小時，然后在8000?16000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn) 速下離心30分鐘，用lmL的PBS洗滌三次，再將沉淀分散于lmL的PBS中，得DNA2修飾轉(zhuǎn) 化酶-膠體金，置于4°C下儲存； (2) 在20?200 μ L鏈霉親和素修飾的磁珠中加入biotin修飾的單鏈DNA1，37°C下反 應(yīng)后，并用PBS洗滌兩次，去除上清液，沉淀分散于lmLPBS緩沖液中，即得DNA1-鏈霉親和 素修飾的磁珠（DNAl-MBs); (3) 取lmL的DNA1-鏈霉親和素修飾的磁珠，加入lmL的DNA2修飾轉(zhuǎn)化酶-膠體金，室 溫震蕩反應(yīng)，然后磁性分離，并用PBS洗滌3次，得L-組氨酸生物傳感器； 其中：所述的轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金按如下的方法制備而成：取10?200 μ L的轉(zhuǎn)化酶加 入裝有l(wèi)mL的膠體金的離心管內(nèi)，在37°C下反應(yīng)10?80分鐘，在8000?16000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn) 速下離心20分鐘，去除未被結(jié)合的酶，再用50 μ L的PBS洗滌3次，得轉(zhuǎn)化酶修飾膠體金 (轉(zhuǎn)化酶-膠體金）； 優(yōu)選的，所述的 DNA1 的部分序列為：5' -GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC ΤΑΤ TCTCTAC-biotin-3' ； 優(yōu)選的，所述的 DNA2 的部分序列為：5' -GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3' ； 其中所述的金納米粒子按如下方法制備而成：先把制備與儲存膠體金溶液所用的玻璃 容器（容量瓶，棕色廣口瓶，圓底燒瓶等）用王水泡洗30分鐘，然后用二次水沖洗干凈，烘 干備用；在100mL圓底燒瓶中加入50mLlmmol/L的HAuC1 4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入 5mL38. 8mmol/L的Na3C6H507，再加熱10分鐘，攪拌15分鐘，冷卻至室溫后用0. 8 μ m的尼龍 膜過濾器過濾，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中于4°C下保存；用掃描電鏡觀察膠體金的粒徑為20-25nm。
2. -種利用權(quán)利要求1制備的生物傳感器檢測L-組氨酸含量的方法，其特征在于：使 用不同濃度的L-組氨酸加入L-組氨酸生物傳感器中反應(yīng)后，通過磁性分離，取出上清液； 在上清液中加入10?200 μ L的0. 5mM蔗糖溶液，37°C下反應(yīng)30?180分鐘，用血糖儀檢 測生成葡萄糖含量，以血糖儀讀數(shù)為分析信號，進(jìn)行L-組氨酸的測定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器在檢測L-組氨酸含量中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于所 述磷酸緩沖液為〇. 1M，pH = 8. 0的配制方法：稱取0. lg KH2P04、1. 45g Na2HP04 · 12H20溶解 于1L水中，即得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測L-組氨酸的生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于 所述PBS緩沖溶液為0. 2M(pH = 7. 4)，其配置方法為：稱取0. 2g KH2P04、8. 0g NaCl、2. 9g Na2HP04 · 12H20及0. 2g KC1溶解于1L水中即得。
【文檔編號】G01N33/68GK104049087SQ201410246965
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】混旭, 柏莉, 徐亞瓊 申請人:青島科技大學(xué)