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一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其包括以下步驟：采用葡萄糖氧化酶催化樣品中的葡萄糖，使之釋放出過氧化氫；同時向樣品中添加辣根過氧化物酶與金納米棒，辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻，待金納米棒的顏色穩(wěn)定后，采用比色法確定樣品中葡萄糖濃度。本發(fā)明特別采用辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻反應(yīng)，使之能夠在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行，操作簡便且對樣品的損傷小，能夠被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、醫(yī)療行業(yè)中進(jìn)行葡萄糖濃度的檢測。
【專利說明】一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物小分子有機物濃度測定的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]貴金屬納米粒子對其自身大小、形狀及組成具有非常敏感的物理性質(zhì)。尤其是金納米粒子在可見光及遠(yuǎn)紅外環(huán)境下，其縱橫比的變化可以可以特別地表導(dǎo)致強烈的局部表面等離子共振(LSPRs)大的表面積和良好的生物兼容性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物傳感載體。
[0003]在生物【技術(shù)領(lǐng)域】，通常需要對樣品中的葡萄糖濃度進(jìn)行測定。由于葡萄牙被氧化后可產(chǎn)生過氧化氫，現(xiàn)有采用將葡萄糖分解出過氧化氫去蝕刻金納米棒，由于在這一蝕刻反應(yīng)中金納米棒各個方向上的蝕刻效率不一致，最終可改變金納米棒的縱橫比后，使金納米棒產(chǎn)生顏色變化，以比色法便確定樣品葡萄糖的濃度。但現(xiàn)有的大部分納米金屬顆粒其對過氧化氫的敏感度降低，上述的蝕刻反應(yīng)需在低pH、高溫、高過氧化氫的環(huán)境下方可進(jìn)行。而樣品中的葡萄糖往往難以提供足量的過氧化氫，故上述的檢測方法敏感度低。且在這種劇烈的反應(yīng)條件下，樣品常常會發(fā)生變質(zhì)。因此現(xiàn)有的金納米棒作為傳感器測定葡萄糖濃度的方法實質(zhì)上并無真正的實用價值?，F(xiàn)有采用鐵離子或銅離子等金屬離子來做催化劑催化上述蝕刻反應(yīng)的，但這種催化劑的特異性較低，對反應(yīng)活化能的降低效果不明顯，且其反應(yīng)條件仍然較為劇烈，致使其無法被實際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明公開一種對低濃度葡萄糖敏感的、特異性高、反應(yīng)條件溫和的利用比色法測定葡萄糖濃度的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其包括以下步驟:
采用葡萄糖氧化酶催化樣品中的葡萄糖，使之釋放出過氧化氫；同時向樣品中添加辣根過氧化物酶與金納米棒，辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻，待金納米棒的顏色穩(wěn)定后，采用比色法確定樣品中葡萄糖濃度。
[0006]所述辣根氧化酶可采用市售產(chǎn)品實現(xiàn)，其由具有308個氨基酸殘基的糖蛋白以及作為活性中心的血紅素組成，并且能催化各種電子供體底物，包括2，3 - 二甲氧基苯酚，鄰甲氧基苯酚，5 -氨基-2，3 - 二氫_1，4的氧化-二氮雜萘二酮(魯米諾)，2，2’ -連氮基-雙(3 -乙基苯并噻唑-6 -磺酸)(ABTS)，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。該催化反應(yīng)具有三個步驟。第一步，具有蛋白質(zhì)外殼的復(fù)合氯化血紅素被過氧化氫氧化，在氯化血紅素和過氧化氫的一個氧原子間形成共價雙鍵，獲得具有氧化高價鐵基(Feiv=O)的氯化血紅素衍生物一化合物I。上述衍生物可通過單電子轉(zhuǎn)移氧化第一底物分子，釋放出η -正離子自由基。得到的的仍然具有氧化高價鐵基的中間產(chǎn)物，即化合物II。第二底物分子通過單電子轉(zhuǎn)移到含有Fe3+的三價血紅素，從而使化合物II含量下降。在這一過程中，氧獲得兩個質(zhì)子形成水分子，從而從所述氧化高價鐵基中釋放出來。如下面的方程所示，在上述的HRP反應(yīng)循環(huán)中，兩個底物分子(AH)被轉(zhuǎn)化為兩個自由基(A.)。
[0007]Native HRP+H202 — Compound I +
Compound I.++AH 一 Compound II++ A'
Compound II++AH — Native HRP+H20+ A'
本發(fā)明中，釆用了辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻反應(yīng)，辣根過氧化物酶能夠有效降低上述蝕刻反應(yīng)的活化能，使反應(yīng)能夠在溫和的條件下進(jìn)行。同時，由于反應(yīng)的活化能降低，微量的過氧化氫也能夠與金納米棒發(fā)生反應(yīng)，從而有效提高了本發(fā)明檢測方法的靈敏度。同時，作為活性中心的血紅素只能與特異性的底物——即過氧化氫和金納米棒一結(jié)合，因此本發(fā)明的方法也具有良好的特異性。所述的比色法可以采用現(xiàn)有的比色法實現(xiàn)，具體而言，即首先配置一個濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述的檢測方法，使之與金納米棒反應(yīng)，當(dāng)金納米棒不再變色后，根據(jù)金納米棒最終的色度制作不同濃度的比色卡。
[0008]進(jìn)一步的，還包 括在辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒蝕刻前，添加鹵化物。
[0009]金納米棒的在制備過程中可能會用到含有鹵元素的表面活性劑。通常而言，在使用金納米棒前，會采用離心法對金納米棒進(jìn)行純化，以除去上述含有鹵元素的表面活性劑。但設(shè)計人在設(shè)計本發(fā)明技術(shù)方案中意外地發(fā)現(xiàn)，若金納米棒上仍有鹵化物殘存時，上述的蝕刻反應(yīng)更加容易進(jìn)行。為排除其他影響因子。設(shè)計人還對純化后的金納米棒另外加入鹵化物，與未加鹵化物的對照組相比，最終驗證得在鹵化物對蝕刻反應(yīng)的促進(jìn)效果。
[0010]更進(jìn)一步的，所述鹵化物可選自十六烷基三甲基溴化銨或碘化鈉或溴化鈉或溴化銨的任一種。
[0011]本發(fā)明還提供一種葡萄糖檢測反應(yīng)體系，其組分包含:葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、金納米棒、鹵化物與硅膠。
[0012]由于辣根過氧化物酶與其他生物酶有較好的相容性，可以將葡萄糖氧化酶與之絡(luò)合，以提高檢測的效率。采用本發(fā)明提供的葡萄糖檢測反應(yīng)體系進(jìn)行檢測時，只需將待測樣品滴加到上述的體系中，便可直接通過肉眼采用比色法完成對樣品中葡萄糖濃度的確定，這一操作簡便、快捷，無需經(jīng)過專業(yè)的訓(xùn)練，特別有利于本技術(shù)的大規(guī)模推廣。
[0013]進(jìn)一步的，所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系中葡萄糖氧化酶的濃度為30— 60nM，辣根過氧化物酶濃度為0.5—2 μ Μ，鹵化物濃度為Ι-lOmM，金納米棒的濃度按金單質(zhì)計為0.10—
0.20mM,以及余量的硅膠。
[0014]更進(jìn)一步的，所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系中還包含有20mM的檸檬酸鹽緩沖液；所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系的PH為3.8 — 4.1。
[0015]辣根氧化物酶及葡萄糖氧化酶在pH為3.8—4.1，具有較高的反應(yīng)活性。超出此范圍，有可能導(dǎo)致兩種酶的失活。檸檬酸鹽緩沖液則能夠使體系的PH處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。
[0016]本發(fā)明還提供一種上述葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，包括以下工序:a.制備金納米棒；b.制備硅酸鹽前體；c.向硅酸鹽前體中添加葡萄糖氧化酶、金納米棒、辣根過氧化物酶、鹵化物及檸檬酸鹽緩沖液；d.固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系。[0017]進(jìn)一步的，葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，其特征在于所述金納米棒的制備是指將濃度為0.05 M的氯金酸溶液0.025-0.030毫升和濃度為0.1 M十六烷基三甲基溴化銨3-5毫升加入新鮮配制的濃度為0.0lM硼氫化鈉溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生長溶液所制成的；所述生長溶液其原料包括濃度0.1M抗壞血酸0.05-0.10毫升、濃度0.05M的氯金酸0.1-0.3毫升、濃度0.0lM硝酸銀0.10-0.15毫升、濃度IM的鹽酸溶液0.15-0.20毫升和0.1M的十六烷基三甲基溴化銨10-20mL。
[0018]進(jìn)一步的，還需除去金納米棒中的鹵素，具體為將制得的金納米棒以7000rpm下離心處理20分鐘，棄去上清液。
[0019]除去金納米棒上殘存的鹵素，有利于實現(xiàn)對體系中鹵化物濃度的精確控制。
[0020]更進(jìn)一步的，制備硅酸鹽前體是指按重量份計，將1-5份的硅酸鈉與10 — 20份的去離子水混合成硅酸鈉溶液，然后向其加入按重量份計3— 8份的陽離子交換樹脂，以除去過酸鈉溶液中的鈉離子和氫離子，直至所述硅酸鈉溶液的PH為3.8-4.1，即獲得所述硅酸鹽前體；所述固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系是指將葡萄糖反應(yīng)體系置于微孔板中，在4°C下靜置48小時。
[0021]在進(jìn)行檢測前的48小時制備本發(fā)明的體系，能夠使葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶均處于較為活躍的狀態(tài)，提高本發(fā)明體系的靈敏度及檢測效率。
[0022]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下有益效果:
1.本發(fā)明特別采用辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻反應(yīng)，使之能夠在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行，操作簡便且對樣品的損傷小，能夠被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、醫(yī)療行業(yè)中進(jìn)行葡萄糖濃度的檢測。
[0023]2.本發(fā)明采用辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻反應(yīng)，在過氧化氫濃度極低的條件下仍能進(jìn)行對金納米棒的蝕刻，最終使得本發(fā)明的檢測方法對樣品中低濃度的葡萄糖具有較高的靈敏度。經(jīng)驗證，本發(fā)明的檢測方法對葡萄糖的靈敏度達(dá)到μ M級。
[0024]3.本發(fā)明構(gòu)建了葡萄糖檢測反應(yīng)體系，采用硅膠將各組分進(jìn)行固定；采用本發(fā)明體系時采用肉眼進(jìn)行比色法便可完成對葡萄糖濃度的檢測，整個檢測過程簡便且效率較高而成本低廉，特別有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是不同過氧化氫濃度下辣根過氧化物酶對金納米棒的蝕刻效果的投射電子顯微鏡圖。
[0026]圖2是辣根過氧化酶存在時不同過氧化氫濃度下金納米棒的長度和寬度。Oa指示的是長度，Ob指示的是寬度。
[0027]圖3是過氧化氫濃度為50 μ Μ，辣根過氧化物酶濃度為I μ M時，加入不同濃度的溴化鈉后金納米棒的可見近紅外光譜圖。其中，I是OmM NaBr，2是ImM NaBr，3是2mM NaBr,4 是 3mM NaBr, 5 是 4mM NaBr, 6 是 6mM NaBr0
[0028]圖4是實施例1-6和對比例中金納米棒的可見紅外光譜圖。其中，7是對比例，8是實施例1，9是實施例2，10是實施例3，11是實施例4，12是實施例5，13是實施例6。
【具體實施方式】[0029]將不同濃度的過氧化氫加入含有金納米棒0.12mM、辣根過氧化物酶1.5 μ Μ、檸檬酸鹽緩沖液20mM、pH為4.0的溶液中。其透射電鏡形貌圖如圖1所示。透射電子顯微鏡的統(tǒng)計分析(TEM)圖像來分析氧化前后的AuNRs的長度和寬度。最初，金納米棒大約60納米長，15納米厚。在加入過氧化氫和辣根過氧化物酶后，納米棒的長度逐漸下降寬度保持不變。如圖2所示。當(dāng)溶液中加入足量的過氧化氫，金納米棒則可能失去其棒狀的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為球形顆粒。當(dāng)金納米棒形狀發(fā)生變化時，其顏色也會相應(yīng)地發(fā)生不同程度的變化。
[0030]設(shè)計人同時發(fā)現(xiàn)齒化物，尤其是溴化物的存在對辣根過氧化物酶催化過氧化氫蝕刻金納米棒的反應(yīng)有正相關(guān)。當(dāng)反應(yīng)體系中無鹵化物存在時，上述的催化反應(yīng)并不會發(fā)生。以溴化物為例，伴隨著加入辣根過氧化物酶催化反應(yīng)體系中溴離子濃度的上升，金納米棒的長度縮短越明顯。圖3是當(dāng)反應(yīng)體系中過氧化氫濃度為50 μ M，辣根過氧化物酶濃度為I μ M時，加入不同濃度的溴化鈉后金納米棒的可見近紅外光譜。很明顯的可以看出，體系中添加的溴化鈉濃度越高，金納米棒的氧化速率越高。除溴化物外，其他的鹵化物諸如氯化物、碘化物也對上述催化反應(yīng)中金納米棒氧化速率的提升有一定的促進(jìn)作用。
[0031]實施例1
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中葡萄糖濃度為80 μ Μ，葡萄糖氧化酶的濃度為50ηΜ，辣根過氧化物酶濃度為0.5 μ Μ，溴化鈉濃度為6mM，金納米棒的濃度按金單質(zhì)計為0.20mM, 20mM的檸檬酸鹽緩沖液，以及余量的硅膠。本實施例葡萄糖檢測反應(yīng)體系的PH為4。
[0032]實施例2
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為0.8 μ M，其余與實施例1 一致。
[0033]實施例3
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為1.1 μ Μ，其余與實施例1 一致。
[0034]實施例4
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為1.4 μ Μ，其余與實施例1 一致。
[0035]實施例5
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為1.7 μ Μ，其余與實施例1 一致。
[0036]實施例6
本實施例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為2 μ Μ，其余與實施例1 一致。
[0037]實施例7
本實施例提供一種葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法a.制備金納米棒；b.制備硅酸鹽前體；c.向硅酸鹽前體中添加葡萄糖氧化酶、金納米棒、辣根過氧化物酶、鹵化物及檸檬酸鹽緩沖液；d.固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系。
[0038]所述金納米棒的制備是指將濃度為0.05 M的氯金酸溶液0.028毫升和濃度為0.1M十六烷基三甲基溴化銨3毫升加入新鮮配制的濃度為0.0lM硼氫化鈉溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生長溶液所制成的；所述生長溶液其原料包括濃度0.1M抗壞血酸0.07毫升、濃度0.05M的氯金酸0.2毫升、濃度0.0lM硝酸銀0.12毫升、濃度IM的鹽酸溶液0.19毫升和0.1M的十六烷基三甲基溴化銨llmL。
[0039]還需除去金納米棒中的鹵素，具體為將制得的金納米棒以7000rpm下離心處理20分鐘,棄去上清液。
[0040]制備硅酸鹽前體是指按重量份計，將2份的硅酸鈉與14份的去離子水混合成硅酸鈉溶液，然后向其加入按重量份計5份的陽離子交換樹脂，以除去過酸鈉溶液中的鈉離子和氫離子，直至所述硅酸鈉溶液的PH為4，即獲得所述硅酸鹽前體；所述固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系是指將葡萄糖反應(yīng)體系置于微孔板中，在4°C下靜置48小時。
[0041]對照例
本對照例提供一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其反應(yīng)體系中辣根過氧化物酶濃度為2 μ Μ，其余與實施例1 一致。
[0042]經(jīng)實施例1-6、對比例處理后，各反應(yīng)體系中金納米棒的可見近紅外光譜圖如圖4。
[0043]采用比色法測定金納米棒時，可設(shè)置不同濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本發(fā)明的方法，獲得不同濃度下金納米棒的顏色，制得標(biāo)準(zhǔn)比色卡。
[0044]由上述數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所提供的一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法及體系可在較為溫和的條件下，對樣品中較低濃度的葡萄糖進(jìn)行定量。
[0045]以上為本發(fā)明的其中具體實現(xiàn)方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些顯而易見的替換形式均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用比色法測定葡萄糖濃度的方法，其包括以下步驟: 采用葡萄糖氧化酶催化樣品中的葡萄糖，使之釋放出過氧化氫；同時向樣品中添加辣根過氧化物酶與金納米棒，辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒的蝕刻，待金納米棒的顏色穩(wěn)定后，采用比色法確定樣品中葡萄糖濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定葡萄糖濃度的方法，其特征在于:還包括在辣根過氧化物酶催化過氧化氫對金納米棒蝕刻前，添加齒化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定葡萄糖濃度的方法，其特征在于:所述鹵化物可選自十六烷基三甲基溴化銨或碘化鈉或溴化鈉或溴化銨的任一種。
4.一種葡萄糖檢測反應(yīng)體系，其組分包含:葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、金納米棒、鹵化物與硅膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系，其特征在于:所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系中葡萄糖氧化酶的濃度為30— 60nM，辣根過氧化物酶濃度為0.5—2μΜ,鹵化物濃度為Ι-lOmM，金納米棒的濃度按金單質(zhì)計為0.10—0.20mM,以及余量的硅膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系，其特征在于:所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系中還包含有20mM的檸檬酸鹽緩沖液；所述葡萄糖檢測反應(yīng)體系的pH為3.8—4.1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，包括以下工序:a.制備金納米棒；b.制備硅酸鹽前體；c.向硅酸鹽前體中添加葡萄糖氧化酶、金納米棒、辣根過氧化物酶、鹵化物及檸檬酸鹽緩沖液；d.固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，其特征在于:所述金納米棒的制備是指將濃度為0.05 M的氯金酸溶液0.025-0.030毫升和濃度為0.1 M十六烷基三甲基溴化銨3-5毫升加入新鮮配制的濃度為0.0lM硼氫化鈉溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生長溶液所制成的；所述生長溶液其原料包括濃度0.1M抗壞血酸0.05-0.10毫升、濃度0.05M的氯金酸0.1-0.3毫升、濃度0.0lM硝酸銀0.10-0.15毫升、濃度IM的鹽酸溶液0.15-0.20毫升和0.1M的十六烷基三甲基溴化銨10-20mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，其特征在于:還需除去金納米棒中的鹵素，具體為將制得的金納米棒以7000rpm下離心處理20分鐘，棄去上清液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的葡萄糖檢測反應(yīng)體系的制備方法，其特征在于:制備硅酸鹽前體是指按重量份計，將1-5份的硅酸鈉與10 — 20份的去離子水混合成硅酸鈉溶液，然后向其加入按重量份計3— 8份的陽離子交換樹脂，以除去過酸鈉溶液中的鈉離子和氫離子，直至所述硅酸鈉溶液的PH為3.8-4.1，即獲得所述硅酸鹽前體；所述固化葡萄糖檢測反應(yīng)體系是指將葡萄糖反應(yīng)體系置于微孔板中，在4°C下靜置48小時。
【文檔編號】G01N21/78GK103954618SQ201410215481
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】葉偉榮, 陳心宇 申請人:葉偉榮