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Igf2bp1自身抗體識別的抗原多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。其中，該多肽具有如SEQID?NO：1-3所示氨基酸序列至少之一。利用本發(fā)明的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽，能夠有效地檢測樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品（例如血清樣品）中的IGF2BP1自身抗體。
【專利說明】IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及一種IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽、該多肽在制備檢測腫瘤血清中IGF2BP1抗體的用途、一種用于檢測樣品中IGF2BP1抗體的試劑盒。
【背景技術(shù)】[0002]肺癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，生物學(xué)特性十分復(fù)雜，早期無創(chuàng)性診斷困難，目前尋找腫瘤相關(guān)標(biāo)志物已成為肺癌早期診斷和免疫治療的研究熱點。但現(xiàn)階段應(yīng)用于臨床的腫瘤標(biāo)志物仍然不多，且對肺癌的早期發(fā)現(xiàn)仍缺乏足夠的敏感性、特異性和可重復(fù)性，因此，目前迫切需要尋找有效腫瘤相關(guān)標(biāo)志物用于肺癌早期診斷。而近年研究表明，腫瘤患者自身免疫系統(tǒng)會對腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生自身抗體，這些自身抗體存在于肺癌患者體循環(huán)中，甚至在肺癌臨床癥狀出現(xiàn)5年前就可以出現(xiàn)了，因此自身抗體可能成為監(jiān)測腫瘤發(fā)生的早期標(biāo)志物。相較于血清中腫瘤抗原型標(biāo)志物，血清中腫瘤抗原相應(yīng)自身抗體同時具有豐度高，易檢測等優(yōu)勢，可能成為更為可靠的血清腫瘤標(biāo)志物，將有助于腫瘤的早期診斷。因此，尋找肺癌抗原相應(yīng)自身抗體，對于肺癌早期診斷以及預(yù)后檢測意義重大。然而，目前相關(guān)報道很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0004]近年來，研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP1 (insulin-like growth factor 2 mRNA bingdingpiOteinl，胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白I)屬于高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的多個方面發(fā)揮重要作用。IGF2BP1在睪丸癌早期原位癌中即有大量表達(dá)，提示其可能成為癌癥發(fā)生的早期標(biāo)志物；而在卵巢癌、結(jié)腸癌的研究中，則證明了 IGF2BP1的高水平表達(dá)與癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后相關(guān)；同時，在肺癌中，IGF2BP1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞低分化程度相關(guān)，并提示可能成為不良預(yù)后的標(biāo)志物。在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)IGF2BP1作為自身抗原，能引起患者血清中自身抗體的表達(dá)變化，這一變化與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)。綜上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IGF2BP1自身抗體可能成為更為有效的腫瘤標(biāo)志物。但是目前尚未有商品化的IGF2BP1自身抗體檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷至少之一，而提供一種有用的商業(yè)選擇。
[0006]為此，本發(fā)明提出了一種IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其多肽活性片段為下列至少之一:
[0007]I) SEQ ID No:1 所示序列:MNKLYIGNLNESVTPADLEK ；
[0008]2) SEQ ID No: 2 所示序列:IAPPETPDSKVRMVIITGPP ;
[0009]3) SEQ ID No: 3 所示序列:RVIGKGGKTVNELQNLTAAE ；
[0010]4) SEQ ID No: 1_3所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。[0011]根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。
[0012]另外，本發(fā)明還提出了前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽在制備檢測腫瘤血清IGF2BP1抗體試劑盒中的用途。尤其是，該試劑盒可以用于檢測的腫瘤為肺癌。
[0013]為此，本發(fā)明提出了一種用于檢測樣品中IGF2BP1抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括:前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:陰性對照樣品，所述陰性對照樣品為IGF2BP1抗體為陰性的血清，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為IGF2BP1抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。根據(jù)本發(fā)明的實施例，IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽的濃度可以為，每個反應(yīng)孔I μ g/ml。根據(jù)本發(fā)明的實施例，尤其是，該試劑盒可以用于檢測的腫瘤為肺癌。
[0014]為此，在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽具有如SEQ ID NO:1-3所示氨基酸序列至少之一。即，該多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0015]MNKLYIGNLNESVTPADLEK (SEQ ID NO:1);
[0016]IAPPETPDSKVRMVIITGPP (SEQ ID NO:2);
[0017]RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品(例如血清樣品)中的IGF2BP1自身抗體。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地所述多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ IDN0:3)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。
[0020]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的用途。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0022]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測樣品中的IGF2BP1自身抗體。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0024]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的多肽對樣品中的IGF2BP1自身抗體進(jìn)行檢測。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA檢測的試劑。由此，可以通過ELISA檢測方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對樣品中的IGF2BP1自身抗體進(jìn)行檢測，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。[0026]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中。由此，可以方便地高通量地進(jìn)行檢測?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0028]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【具體實施方式】
[0029]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0030]IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽
[0031]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其多肽活性片段為下列至少之一:
[0032]I) SEQ ID No:1 所示序列:MNKLYIGNLNESVTPADLEK ；
[0033]2) SEQ ID No: 2 所示序列:IAPPETPDSKVRMVIITGPP ;
[0034]3) SEQ ID No: 3 所示序列:RVIGKGGKTVNELQNLTAAE ；
[0035]4) SEQ ID No: 1_3所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
`[0036]根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。
[0037]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽具有如SEQ ID NO:1-3所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0038]MNKLYIGNLNESVTPADLEK (SEQ ID NO:1);
[0039]IAPPETPDSKVRMVIITGPP (SEQ ID NO:2);
[0040]RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)。
[0041]需要說明的是，上述多肽均來自于IGF2BP1的全長序列所對應(yīng)的(IGF2BP1的全長序列見NCBI NP_006537)。另外，在本文中所使用的術(shù)語“多肽”是指至少兩個氨基酸通過肽鍵連接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸殘基的數(shù)目并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，多肽可以含有20個氨基酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，還可以對上述多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品(例如血清樣品)中的IGF2BP1自身抗體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從IGF2BP1完整序列得到的上述多肽可以作為IGF2BP1的抗原表位，能夠與血液樣本中IGF2BP1自身抗體特異性的反應(yīng)，因而，可以有效地用于檢測對象血液樣本中的IGF2BP1自身抗體，由此，可以有效地用于篩查肺癌疑似患者血清，為肺癌的診斷提供了一個新的檢驗指標(biāo)。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選地所述多肽具有如SFFFLSH1ISNLQFNSSLED (SEQ IDNO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。
[0043]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以有效地通過常規(guī)合成方法，合成上述多肽，從而代替重組表達(dá)的生物合成方式。
[0044]IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽的應(yīng)用及試劑盒
[0045]由此，在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了前面所述多肽在檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以用上述多肽進(jìn)行檢測的樣品的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選的樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣本。由此，可以利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣本中的IGF2BP1自身抗體，由此可以確定患者是否患有惡性腫瘤，為惡性腫瘤檢測提供輔助手段，或者提供惡性腫瘤例如肺癌的早期篩查。另外，還可以通過檢測對象血液中IGF2BP1自身抗體的存在，而對患者進(jìn)行預(yù)后預(yù)測分析。
[0046]利用本發(fā)明的多肽檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，借助本發(fā)明的多肽檢測樣品中的IGF2BP1自身抗體。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體的效率。作為示例，可以采用下列方法利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1抗體:
[0047]首先，用ρΗ9.6 的碳酸鹽緩沖液(NaCO30.159g, NaHCO30.293g，加水至 100ml，pH 值為9.6)稀釋多肽至I μ g/ml,以100 μ I/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4°C過夜。
[0048]接下來，棄去孔中的液體，0.P/oTBS-T洗滌緩沖液(B卩含0.l%Tween-20的TBS-T溶液，其配制方法為:NaC18.7g，Trisl.21g，加去離子水至1000ml，pH7.5，再加入Tween-20 lml)洗漆酶標(biāo)板5次,每次3min。
[0049]接著，向孔中添加5%BSA/0.05%TBS_T封閉緩沖液(其配制方法為:NaC10.87g，Tris0.121g，加去離子水至 100ml, ρΗ7.5，再加入 Tween-200.5ml, BSA5g)，每孔 300 μ 1，封板膜密封后37°C孵育Ih。
[0050]接著，添加待測樣品。用5%BSA/0.05%TBS-T封閉緩沖液稀釋血清，稀釋比例為1:100，完全棄去孔中液體，每孔加血清稀釋液100 μ 1，每例血清樣本3個復(fù)孔，每板設(shè)立2個陽性對照孔，加入已知陽性血清，每板設(shè)立2個空白對照孔，加入0.P/oTBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37°C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0051]接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用5%BSA/0.05%TBS-T封閉緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加100μ 1，封板膜密封后37°C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0052]接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說明書(例如康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒)，加入顯色底物，每孔加入100 μ 1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50μ 12M H2SO4終止反應(yīng)。
[0053]接著，酶標(biāo)儀492nm波長條件下測定光密度OD值。
[0054]最后，基于所得到的光密度OD值與預(yù)定的參考值的區(qū)別，確定待測樣品是否來自于患有肺癌患者。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以利用確診癌癥患者和健康人(健康志愿者)的血液樣品進(jìn)行平行試驗所得到的數(shù)值作為預(yù)定的參考值。
[0055]例如，用ELISA方法檢測血液樣本中的抗IGF2BP1的自身抗體水平。如果待測樣本中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度值高于X+2SD，則待測血清為肺癌疑似患者血清，其中，在X+2SD中，X為健康人血清中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度平均值，2SD為健康人血清中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度值的二倍標(biāo)準(zhǔn)差。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明所采用的X+2SD值是通過下列方法獲得的:按照前述利用本發(fā)明的多肽檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的方法，采用89例健康對照血液樣本，測定其酶底物顯色反應(yīng)的OD值，將測得的OD值以單樣本K-S檢驗分析符合正態(tài)分布(p>0.05)后，計算獲得各OD值的平均值(X=0.17)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD=0.09)，則以X+2SD (0.35)為正常值的上限。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽在制備檢測腫瘤血清IGF2BP1抗體試劑盒中的用途。尤其是，該試劑盒可以用于檢測的腫瘤為肺癌。另外,利用該試劑盒還可以通過檢測對象血液中IGF2BP1自身抗體的存在，而對患者對治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0057]為此，根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測樣品中IGF2BP1抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括:前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:陰性對照樣品，所述陰性對照樣品為IGF2BP1抗體為陰性的血清，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為IGF2BP1抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。根據(jù)本發(fā)明的實施例，IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽的濃度可以為，每個反應(yīng)孔Iyg/ml。根據(jù)本發(fā)明的實施例，尤其是，該試劑盒可以用于檢測的腫瘤為肺癌。在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測樣品中的IGF2BP1自身抗體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品。由此，可以利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1自身抗體，由此可以確定患者是否患有惡性腫瘤，為惡性腫瘤檢測提供輔助手段，或者監(jiān)控惡性腫瘤例如肺癌的進(jìn)展。另外，利用該試劑盒還可以`通過檢測對象血液中IGF2BP1自身抗體的存在，而對患者對治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0058]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測樣品中IGF2BP1自身抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的多肽對樣品中的IGF2BP1抗體進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA檢測的試劑。由此，可以通過ELISA檢測方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對樣品中的IGF2BP1抗體進(jìn)行檢測，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1抗體的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中，例如可以包被96孔板的孔，例如可以通過常規(guī)處理如借助包被液和阻滯液進(jìn)行。由此，可以方便地高通量地進(jìn)行檢測?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的IGF2BP1抗體的效率。試劑盒中還可以包含其他試劑，例如沖洗緩沖液，樣品稀釋緩沖液，TMB底物溶液，反應(yīng)終止液，辣根酶標(biāo)記的二抗，陰性對照樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中，陰性對照樣品為IGF2BP1抗體為陰性的血清，標(biāo)準(zhǔn)樣品為IGF2BP1 抗體濃度分別為 lU/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml 的血清。[0059]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述樣品為來自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品。
[0060]另外，利用該試劑盒還可以通過檢測對象血液中IGF2BP1自身抗體的存在，而對患者對治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0061]需要說明的是，在本文中，有時也將“IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽”簡稱為“多肽”，將“IGF2BP1自身抗體”簡稱為“IGF2BP1抗體”。
[0062]下面通過具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行解釋。需要說明的是，下列實施例僅僅是說明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明。另外，下列實施例中所采用的所有儀器、材料等均為市售可得的，如在下列實施例中沒有明確指出的操作，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的操作方法進(jìn)行。
[0063]實施例1多肽的制備
[0064]1.1 一般方法
[0065]依據(jù)IGF2BP1蛋白的全長氨基酸殘基序列(NP_006537)，采用原位合成技術(shù)在活化纖維素膜表面合成長度為18~20的多肽的多肽芯片(Piptide Array)，每個多肽直接順
序重疊10個氨基酸殘基。
[0066]1.2原位合成制備多肽芯片(Piptide Array)
[0067]根據(jù)蛋白及多肽氨基酸殘基長度、重疊序列長度進(jìn)行多肽合成儀ASP SL (德國，intavis公司)MutilPep合成 控制程序設(shè)定,依據(jù)程序控制在每個合成周期添加一種特定氨基酸到活化的硝酸纖維素膜表面合成位點，并催化氨基酸之間肽鍵形成。合成肽鏈長度為20個氨基酸殘基，需進(jìn)行20個周期的反應(yīng)，按照ASP SL多肽合成儀的操作流程，將20種FMOC-基團(tuán)保護(hù)的天然氨基酸溶液放到機器上對應(yīng)的位置。每個周期之間氨基酸要經(jīng)過帽化，F(xiàn)MOC-基團(tuán)脫保護(hù)等一系列的過程才能與下一個氨基酸結(jié)合，最后一個周期結(jié)束時，要將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)脫掉。其步驟為:多肽合成儀ASP SL將指定的氨基酸滴加到硝酸纖維素膜上特定的位置，2%的乙酸酐溶液洗膜5分鐘，二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分鐘。20%的哌啶溶液洗膜10分鐘脫去FMOC-保護(hù)基團(tuán)，二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分鐘。乙醇洗膜2次，每次2分鐘，晾干。重復(fù)上述操作，直到完成20個周期，最后一個周期結(jié)束時20%的哌啶溶液洗膜2次，每次10分鐘。二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分鐘。乙醇洗膜2次后晾干過夜。最后，IOml三氟乙酸,300 μ I 二氯甲烷,200 μ I水充分混合,用混合液洗膜I小時，脫去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，二氯甲烷洗膜5次，每次2分鐘。二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分鐘。乙醇洗膜2次后晾干。多肽芯片合成后在一 20°C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0068]實施例2篩選與肺癌相關(guān)的多肽
[0069]2.1多肽芯片的水化
[0070]首先，將實施例1所制備的多肽芯片浸入40mll00%乙醇中，搖床上搖5分鐘。然后，將該多肽芯片浸入40ml75%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接下來，將多肽芯片浸入40ml50%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接著，加入150ml PBS浸泡30分鐘(以膜上的白點完全退色為準(zhǔn))。最后，將將多肽芯片浸入40ml5%脫脂奶粉/PBS-T溶液中，室溫下孵育3小時進(jìn)行封閉。
[0071]2.2多肽陣列與血清反應(yīng)
[0072]將10例肺癌患者血清等量混合，制備肺癌血清池，用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液I: 1000稀釋制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按0.lml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡，封膜機封口，4°C輕輕振蕩過夜。
[0073]將10例健康對照血清混合，制備健康對照血清池，用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液I: 1000稀釋制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按0.lml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡，封膜機封口，4°C輕輕振蕩過夜。
[0074]血清免疫反應(yīng)結(jié)束后，剪開雜交袋，棄去反應(yīng)液，PBS_T40ml洗多肽芯片6次，每次10分鐘，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，加1:10000稀釋的山羊抗人IgG溶液，按0.lml/cm2加二抗反應(yīng)液，封好雜交袋，室溫下輕輕振蕩2小時，40ml PBS-T洗膜3次，每次10分鐘，40mlPBS洗膜3次，每次10分鐘。
[0075]接下來，進(jìn)行ECL顯影，曝光，將膠片進(jìn)行掃描，用AlphaView軟件系統(tǒng)分析圖像。
[0076]2.3 篩選
[0077]根據(jù)上述Piptide Array免疫反應(yīng)結(jié)果,挑選與肺癌患者血清反應(yīng)陽性而與健康對照組血清反應(yīng)陰性的差異多肽點(序列見表1 )，組成多肽原位Dot-Blot膜，按照實施例1中所述制備方法，制備包含這5條多肽及對照在內(nèi)的多肽芯片，通過與29例肺癌患者血清進(jìn)行免疫反應(yīng)計算各點陽性頻度值，確定特異性序列(見下表1)。如表1所示，其中，敏感性最高的是 RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)。
[0078]表1
【權(quán)利要求】
1.一種IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段為下列至少之一:
1)SEQ ID No:1 所示序列:MNKLYIGNLNESVTPADLEK ；
2)SEQ ID No: 2 所示序列:IAPPETPDSKVRMVIITGPP ；
3)SEQ ID No: 3 所示序列:RVIGKGGKTVNELQNLTAAE ； 4)SEQ ID No: 1-3所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽，其特征在于，所述多肽具有如 RVIGKGGKTVNELQNLTAAE (SEQ ID NO:3)所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽在制備檢測腫瘤血清IGF2BP1自身抗體試劑盒中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為肺癌。
5.一種用于檢測樣品中IGF2BP1抗體的試劑盒，其特征在于，包括: 權(quán)利要求1或2所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，包括: 96孔板，所述96孔板的孔中包被權(quán)利要求1或2所述的IGF2BP1自身抗體識別的抗原·多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:陰性對照樣品，所述陰性對照樣品為IGF2BP1抗體為陰性的血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為IGF2BP1抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述IGF2BP1自身抗體識別的抗原多肽的濃度為，每個反應(yīng)孔I μ g/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品為腫瘤血清，任選地，所述腫瘤為肺癌。
【文檔編號】G01N33/574GK103848889SQ201210506722
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月30日
【發(fā)明者】岳文濤, 張麗娜, 王玥, 趙曉婷, 顧勐 申請人:北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所