久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

結(jié)直腸癌惡性程度及其轉(zhuǎn)移的免疫組化診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)直腸癌惡性程度及其轉(zhuǎn)移的免疫組化診斷試劑盒，該試劑盒包含：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑，其特征在于所述的一抗為人源抗S100A8單克隆抗體或鼠源S100A8單克隆抗體，所述的二抗為生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。利用該試劑盒，通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸病理組織表面S100A8抗原的表達(dá)，能快速準(zhǔn)確地判斷結(jié)直腸癌惡性程度及轉(zhuǎn)移情況，為結(jié)直腸癌的臨床診斷提供幫助。
【專利說(shuō)明】結(jié)直腸癌惡性程度及其轉(zhuǎn)移的免疫組化診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤免疫診斷試劑盒，具體涉及用于結(jié)直腸癌免疫組化試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]SlOO蛋白是由小分子量蛋白(10-14 kDa)組成的鈣結(jié)合蛋白家族，因其在中性pH條件下能溶解于100%飽和度硫酸銨中而得名。研究發(fā)現(xiàn)，此類蛋白只在脊柱動(dòng)物中表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)23種SlOO蛋白家族成員。S100A8蛋白是SlOO蛋白家族的重要成員之一，具有SlOO蛋白家族特征性的保守EF手型結(jié)構(gòu)和4-螺旋環(huán)形，通過(guò)與Ca2+、Zn2+及Cu2+等不同金屬離子結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，暴露與靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而通過(guò)與相應(yīng)的效應(yīng)靶蛋白相互作用參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)效應(yīng)。雖然國(guó)內(nèi)外研究表明，S100A8在胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌中顯著高表達(dá)，但對(duì)于S100A8蛋白與特定腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及其S100A8在特定腫瘤診斷治療中的應(yīng)用，尚缺少更深入的實(shí)驗(yàn)和研究。
[0003]結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)2008年國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)(IARC)研究統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)每年約有一百萬(wàn)人發(fā)生結(jié)直腸癌，全球結(jié)直腸癌死亡率占腫瘤總死亡率8%，腫瘤致死率排名第四，且我國(guó)結(jié)直腸癌病死率高達(dá)45.5%,而結(jié)直腸腫瘤的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生與腫瘤致死密切相關(guān)。因此，尋找一種快速判斷結(jié)直腸癌惡性程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速便捷地診斷結(jié)直腸癌惡性程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的免疫組化檢測(cè)試劑盒，用本發(fā)明的免疫組化試劑盒，檢測(cè)結(jié)直腸病理組織表面S100A8抗原的表達(dá)，以此能快速準(zhǔn)確地判斷結(jié)直腸癌惡性程度及轉(zhuǎn)移情況。
[0005]為達(dá)到上述發(fā)明目的，發(fā)明人提供一種診斷結(jié)直腸癌惡性程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的免疫組化檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含:內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑。所述的一抗為人源抗S100A8單克隆抗體或鼠源抗S100A8單克隆抗體，所述的二抗為生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0006]本發(fā)明中，常規(guī)各種用于免疫組化試驗(yàn)的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、酶、顯色劑均可用于本發(fā)明試驗(yàn)盒，但作為最佳選擇，本發(fā)明中所述的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑優(yōu)選3 wt%H202，所述的非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑優(yōu)選為非免疫羊血清，所述酶優(yōu)選鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，所述顯色劑優(yōu)選DAB顯色劑，包括:DAB緩沖液(20 X )，DAB 底物(20 X )，DAB 色原(20 X )。
[0007]更進(jìn)一步地，作為本發(fā)明試劑盒的優(yōu)化，還在試劑盒中設(shè)置用于參照的比對(duì)色卡，以方便對(duì)待測(cè)樣本的染色結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，或者設(shè)置對(duì)待測(cè)樣本切片中染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算的計(jì)數(shù)器，以便于對(duì)樣本染色結(jié)果做快速分析。
[0008]發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):S100A8在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸組織，并且，S100A8蛋白的表達(dá)水平在不同分化程度結(jié)直腸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度存在顯著差別，高、中、低分化結(jié)直腸癌組織中，S100A8蛋白表達(dá)的強(qiáng)陽(yáng)性率呈明顯遞增趨勢(shì)，即分化程度越低，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平越高，分化程度越高，表達(dá)水平越低；同時(shí)，在轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中，S100A8蛋白陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移癌組織。因此，檢測(cè)受試者結(jié)直腸組織表面S100A8的表達(dá)水平，可以作為結(jié)直腸癌的惡性程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷的分子標(biāo)志物。因此，發(fā)明人提供上述免疫組化試劑盒，利用該試劑盒，通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸病理組織表面S100A8抗原的表達(dá)，能快速準(zhǔn)確地判斷結(jié)直腸癌惡性程度及轉(zhuǎn)移情況，為結(jié)直腸癌的臨床診斷提供幫助。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1:分析 NCBI GEO DataSets 系列 GSE9348 中探針 202917_s_at 所對(duì)應(yīng)的 S100A8在12例正常結(jié)直腸組織和70例結(jié)直腸癌組織的RNA表達(dá)結(jié)果圖。
[0010]圖2:免疫組化檢測(cè)正常結(jié)直腸組織及高、中、低分化結(jié)直腸癌組織中S100A8蛋白的表達(dá)結(jié)果圖，A-F圖均為顯微鏡下放大200倍的組織結(jié)構(gòu)圖，其中:
A圖:正常結(jié)直腸組織陰性對(duì)照(未加S100A8 —抗)；
B圖:結(jié)直腸癌組織陰性對(duì)照(未加S100A8 —抗)；
C圖:正常結(jié)直腸組織；
D圖:高分化結(jié)直腸癌組織；
E圖:中分化結(jié)直腸癌組織；
F圖:低分化結(jié)直腸癌組織。
[0011]圖3:免疫組化檢測(cè)非轉(zhuǎn)移癌和轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中S100A8蛋白的表達(dá)結(jié)果圖，以下A、B圖均為顯微鏡下放大200倍的組織結(jié)構(gòu)圖，其中:
A圖:非轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織；
B圖:轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織。
[0012]圖4:S100A8蛋白在正常結(jié)直腸組織及癌組織中表達(dá)的IHC結(jié)果比較。
[0013]圖5:S100A8蛋白在不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的IHC結(jié)果比較。
[0014]圖6:S100A8蛋白在結(jié)直腸非轉(zhuǎn)移癌和轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)的IHC結(jié)果比較。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1結(jié)直腸癌惡性程度及轉(zhuǎn)移免疫組化診斷試劑盒的制備
發(fā)明人利用NCBI高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO DataSets (gene expression omnibus),對(duì)系列GSE9348中70例結(jié)直腸癌組織和12例正常結(jié)直腸組織進(jìn)行S100A8 RNA水平芯片數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如附圖1所示。通過(guò)該研究發(fā)現(xiàn):S100A8在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸組織，P〈0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)明人通過(guò)免疫組化進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明:S100A8在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸組，并且S100A8蛋白的表達(dá)水平在不同分化程度結(jié)直腸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度存在顯著差別，高、中、低分化結(jié)直腸癌組織中，S100A8蛋白表達(dá)的強(qiáng)陽(yáng)性率呈明顯遞增趨勢(shì)，即分化程度越低，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平越高，分化程度越高，表達(dá)水平越低；同時(shí)，在轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中，S100A8蛋白陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移癌組織。因此，檢測(cè)受試者結(jié)直腸組織表面S100A8的表達(dá)水平，可以作為結(jié)直腸癌的惡性程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷的分子標(biāo)志物。[0016]基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明制備出一種診斷結(jié)直腸癌惡性程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的免疫組化檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含:內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑。所述的一抗為人源抗S100A8單克隆抗體或鼠源S100A8單克隆抗體，所述的二抗為生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0017]常規(guī)各種用于免疫組化試驗(yàn)的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、酶、顯色劑均可用于本發(fā)明試驗(yàn)盒，但作為最佳選擇，本實(shí)施例中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑為3 wt%H202，所述的非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑為非免疫羊血清，所述酶為鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，所述顯色劑為DAB顯色劑，包括:DAB緩沖液(20X)，DAB底物(20X)，DAB 色原(20X)。
[0018]在試劑盒中設(shè)置用于參照的比對(duì)色卡，分別為淡黃色、黃色和棕褐色。并設(shè)置一個(gè)掃描計(jì)數(shù)器，該計(jì)數(shù)器包括一個(gè)能對(duì)切片的顯微圖片進(jìn)行掃描單元，并包含一個(gè)對(duì)所掃描到的圖片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的分析單元。用該計(jì)數(shù)器，能對(duì)待所測(cè)樣本切片中染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算，以便于對(duì)樣本染色結(jié)果做快速分析。
[0019]實(shí)施例2用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測(cè)結(jié)直腸癌組織樣本
(1)烤片脫蠟:取結(jié)直腸癌患者組織，將待染色的組織切片放入60°c烤箱內(nèi)烘烤60-90分鐘(視切片質(zhì)量而定)后迅速放入二甲苯(1、II)中浸泡10分鐘X2次進(jìn)行脫蠟；
(2)水化:切片按順序置于以下梯度酒精中:100%乙醇中浸泡5分鐘一90%乙醇中浸泡5分鐘一75%乙醇中浸泡5分鐘一50%乙醇中浸泡5分鐘一蒸餾水中浸泡3分鐘一PBS洗滌3分鐘X3次；
(3)抗原修復(fù):0.01M pH6.0的檸檬酸抗原修復(fù)液在微波爐中煮沸，切片放入其中，乳膠手套封住容器口，繼續(xù)在沸水中加熱15-20分鐘，使溫度保持在100°C，完畢容器自然冷卻至室溫，不要將切片從修復(fù)液中取出，后再用I X PBS緩沖液搖床上漂洗3分鐘X 3次；` (4)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:將切片置于孵育盒中，用蠟筆將組織圈起來(lái)，以免滴加后的試劑擴(kuò)散，吸水紙將切片上的水稍吸去，不要碰到組織，用3 wt%H202溶液100 μ I覆蓋組織后室溫孵育30分鐘，以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用IXPBS緩沖液搖床上漂洗3分鐘Χ3次；
(5)非特異性結(jié)合位點(diǎn)血清封閉:吸水紙將切片上的水稍吸去，滴加非免疫羊血清，100 μ 1，封閉30分鐘，輕輕甩去上清，不漂洗；
(6)—抗孵育:在孵育盒中，滴加IXPBS稀釋后的鼠源抗S100A8單克隆抗體溶液(購(gòu)自ABNOVA公司)；1:200稀釋，每張切片約100 μ 1，37°C孵育1_2小時(shí)，或4°C過(guò)夜，然后IXPBS緩沖液搖床上3分鐘X 3次漂洗。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。；
(7)二抗孵育:吸水紙將切片上的水稍吸去，生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgGlOO μ I (購(gòu)自福州邁新)，室溫15分鐘，IXPBS緩沖液搖床上3分鐘X 3次進(jìn)行漂洗；
(8)吸水紙將切片上的水稍吸去，每張切片滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶100 μ 1，室溫孵育15分鐘，再用I XPBS緩沖液搖床上3分鐘X 3次進(jìn)行漂洗；
(9)顯色及終止:吸水紙將切片上的水稍吸去，勿干片，滴加DAB顯色液DAB緩沖液(20X)、DAB底物(20X )、DAB色原(20父)各5(^1滴加至850 μ I雙蒸水中配制成ImL新鮮顯示液，有效使用時(shí)間為30分鐘進(jìn)行顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間為60秒，染至棕黃色或黃褐色，完畢自來(lái)水中終止反應(yīng)；(10)復(fù)染:吸水紙將切片上的水稍吸去，滴加蘇木素復(fù)染15秒，迅速用自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，自來(lái)水返藍(lán)5-10分鐘；
(11)脫水透明:晾干后依次入50wt%乙醇、75 wt%乙醇、90 wt%乙醇、100 wt%乙醇各2分鐘快速脫水。再入二甲苯中2分鐘進(jìn)行透明；
(12)封片:待切片自然晾干后,滴加中性樹(shù)膠及蓋玻片封片。
[0020]實(shí)施例3用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)直腸癌組織樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證
用上述實(shí)施例1的試劑盒，依據(jù)實(shí)施例2的方法和步驟，檢測(cè)了 54例正常和104例結(jié)直腸癌大體標(biāo)本中S100A8蛋白的表達(dá)。所有組織標(biāo)本在手術(shù)后經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院病理科進(jìn)行病理證實(shí)；104例結(jié)直腸腫瘤標(biāo)本中58例為非轉(zhuǎn)移癌，46例為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌；其中96例可用于惡性程度分析:14例高分化癌，48例中分化癌，34例低分化癌。
[0021]依據(jù)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，分別以蛋白表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分。判斷陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn):(1)根據(jù)陽(yáng)性染色強(qiáng)度判斷:細(xì)胞無(wú)染色記O分；細(xì)胞染成淡黃色，記I分；黃色，記2分；棕褐色，記3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)記分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 5%，記O分;5%~25%，記I分；26%~50%，記2分;51%~75%，記3分，>75%,記4分。最終計(jì)分結(jié)果為上述兩種判斷標(biāo)準(zhǔn)得分相加。結(jié)果評(píng)估:0分為陰性表達(dá)(_);1、2分為弱陽(yáng)性表達(dá)(+ );3飛分為中等陽(yáng)性(+ );6、7分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+ )。分析組織中S100A8免疫組化的結(jié)果表明，S100A8蛋白在97.12% (101/104)的結(jié)直腸癌和37.93% (22/58)的正常結(jié)直腸組織中表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖4和圖2，即在結(jié)直腸癌組織中S100A8蛋白表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸組織O^= 68.15，p=0.00)。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，S100A8蛋白的表達(dá)水平在不同分化 程度結(jié)直腸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度有差別，I 2=?.73，P=0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高、中、低分化癌強(qiáng)陽(yáng)性率分別為14.28%,43.75%和61.76%，呈明顯遞增趨勢(shì)，即分化程度越低，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平越高，見(jiàn)圖5和圖2 ;而在轉(zhuǎn)移癌組織中，S100A8蛋白陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移癌組織CT "=4.21, P=0.04)，見(jiàn)圖6和圖3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0022]進(jìn)一步的臨床應(yīng)用表明，本發(fā)明的試劑盒能用于通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中S100A8蛋白表達(dá)水平從而準(zhǔn)確判斷結(jié)直腸癌的組織分化程度以及轉(zhuǎn)移情況，有助于快速便捷地診斷結(jié)直腸癌。
[0023]應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述公開(kāi)內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)的權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.結(jié)直腸癌惡性程度及其轉(zhuǎn)移的免疫組化診斷試劑盒，該試劑盒包含:內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑、一抗、二抗、酶、顯色劑，其特征在于所述的一抗為人源抗S100A8單克隆抗體或鼠源抗S100A8單克隆抗體，所述的二抗為生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑為3wt%H202，所述非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑為非免疫動(dòng)物血清，所述酶為鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，所述顯色劑為DAB顯色劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷劑為非免疫羊血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述之一的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中設(shè)置用于染色參照的比對(duì)色卡，所述比對(duì)色卡有三張，分別為淡黃色、黃色和棕褐色。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述之一的試劑盒，其特征在于:試劑盒中設(shè)置對(duì)待測(cè)樣本切片中染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算的計(jì)數(shù)器。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒中設(shè)置對(duì)待測(cè)樣本切片中染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算的計(jì)數(shù)器。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103487583SQ201310478851
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】沈守榮, 馬健, 張學(xué)梅, 李夏雨, 李楠, 唐岸柳 申請(qǐng)人:中南大學(xué)