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一種利用aflp-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的方法，屬分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括樣本DNA的提取、DNA樣本的雙酶切及雙酶切產(chǎn)物的連接、連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測、結(jié)果分析與鑒別。該方法成功地建立了燈盞花新品種千山2號的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，能容易、精確地鑒別樣品是否是燈盞花新品種千山2號，為保護(hù)燈盞花新品種千山2號提供了科學(xué)的依據(jù)。
【專利說明】—種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性(amplifiedfragment length polymorphism, AFLP)-毛細(xì)管電泳技術(shù),分子鑒別燈蓋花新品種千山2號。
【背景技術(shù)】
[0002]燈蓋花[Erigeronbreviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.]為菊科飛蓬屬多年生植物，是治療心腦血管類疾病的良好天然藥物，以其總黃酮及其燈盞乙素、咖啡酰奎寧酸類化合物為活性成分開發(fā)有4個注射液品種，是云南省最具發(fā)展?jié)摿Φ乃幱弥参镏弧?br> [0003]燈盞乙素(scutellarin)是燈盞花的主要功能成分之一。燈盞乙素含量高低決定了藥材的療效，也是鑒別藥材質(zhì)量好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)。由于社會對燈盞花藥材需求量的不斷增長，野生資源已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足社會需求。本發(fā)明人在燈盞花種質(zhì)資源收集與評價的基礎(chǔ)上(楊生超等.燈盞花種質(zhì)資源群體表型多樣性研究.西北植物學(xué)報，2008，28
(8): 1573-1579)，系統(tǒng)地開展了燈盞花的育種研究(楊生超等，燈盞花新品系選育及農(nóng)藝與品質(zhì)性狀比較，中國中藥雜志，2010，35 (5): 554-557)，從馴化栽培的燈盞花種源QS-1 (於西種源)天然異交群體中選育出燈盞花新品種千山2號，燈盞花新品種千山2號于2009年通過了由云南省農(nóng)業(yè)廳、云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中科院昆明植物研究所、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、瀘西縣農(nóng)業(yè)局等單位的專家組成的藥用植物品種鑒定專家組的品種鑒定。從2009年至今，千山2號已經(jīng)累計推廣超過2000hm2，`極大地促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民增收。
[0004]千山2號的主要農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀為:葉主要集中于基部，基部葉密集，蓮座狀，花期生存，多為匙形，少為倒披針形，長16.7~35.7cm,寬1.45~2.6cm,其植株中燈盞乙素含量為3.5%左右，畝含燈盞乙素為11.38kg左右，較對照高39.31%(對照QS-1)，適應(yīng)性較好、抗逆性強(qiáng)，田間有輕微的霜霉病和根腐病發(fā)生，未見其他病害發(fā)生，抗病性好。
[0005]燈盞花種植目前采用“公司”+ “農(nóng)戶”的模式，新品種種子很容易外流。不同地區(qū)的野生燈盞花藥材的燈盞乙素含量不同，如云南(燈盞乙素含量0.713%)最高，四川(燈盞乙素含量0.61%)和貴州(燈盞乙素含量0.539%)次之，廣西(燈盞乙素含量0.443%)最低(劉鵬等，HPLC法測定不同產(chǎn)地?zé)舯K細(xì)辛中燈盞乙素的含量，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27
(9):781)。由于千山2號新品種植株中燈盞乙素含量高，千山2號藥材的市場價格比其它燈盞花藥材的價格高2倍多，收購燈盞花藥材時也發(fā)現(xiàn)一些利用燈盞乙素含量顯著低于千山2號的野生燈盞花以次充好的現(xiàn)象，造成藥材市場混亂、質(zhì)量良莠不齊，給藥品質(zhì)量控制帶來了極大的隱患，為此研究燈盞花新品種千山2號的快速、準(zhǔn)確的分子鑒別方法，對于保護(hù)新品種權(quán)，鼓勵創(chuàng)新、醫(yī)藥質(zhì)量控制均具有重要意義。
[0006]目前，以DNA水平為基礎(chǔ)的分子檢測鑒別技術(shù)包括PCR技術(shù)、RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、AFLP技術(shù)、SSR和ISSR技術(shù)、多位點(diǎn)小衛(wèi)星DNA指紋技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及SNP技術(shù)等。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，Amplified FragmentLength Polymorphism)具有DNA需要量少、檢測效率高、多態(tài)性高、可靠性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已在動物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究上應(yīng)用。植物學(xué)研究中的應(yīng)用主要在種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等。但到目前為止，還沒有應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對燈盞花進(jìn)行分子鑒別，也沒有用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)對不同區(qū)域燈盞花進(jìn)行分子鑒別及對燈盞花新品種千山2號的分子鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是提供一種能快速、準(zhǔn)確、方便地對燈盞花新品種千山2號進(jìn)行分子鑒別的方法，為新品種保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)燈盞花產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
[0008]本發(fā)明所提供的一種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的方法，包括以下步驟:
[0009](I)樣本DNA的提取，以千山2號為對照樣本，分別取對照樣本和待鑒別樣本0.1g,分別按照CTAB法提取總DNA，總DNA經(jīng)RNA酶純化，并用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，OD值達(dá)到1.8-2.0，將總DNA稀釋到200ng/ μ 1，即得對照DNA樣本和待鑒別DNA樣本；
[0010](2) AFLP 擴(kuò)增
[0011]①DNA樣本的雙酶切及雙酶切產(chǎn)物的連接，分別將步驟(1)獲得的對照樣本的DNA樣本和待鑒別樣本的DNA樣本用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mse I雙酶切，在各雙酶切產(chǎn)物中加入EcoR I接頭、Mse I接頭和Τ4連接酶進(jìn)行連接，得到對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物，所述的EcoR I接頭的序列由A序列和B序列組成，所述的EcoR I接頭的A序列的堿基序列如SEQ ID NO:1 所示，所述的EcoR I接頭的B序列的堿基序列如SEQ IDNO:2所示，所述的Mse I接頭的序列由C序列和D序列組成，所述的Mse I接頭的C序列的喊基序列如SEQ ID NO:3所不，所述的Mse I接頭的D序列的喊基序列如SEQ ID NO:4所示；
[0012]②連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增，分別在步驟(2)①獲得的對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物中加入預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min,然后進(jìn)入循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性35s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共35個熱循環(huán)，4°C冷卻后，取出對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的預(yù)擴(kuò)增引物由上游引物E和下游引物M組成，所述的上游引物E的堿基序列如SEQ IDNO:5所示，所述的下游引物M的堿基序列如SEQ ID NO:6所示；
[0013]③選擇性擴(kuò)增，分別將步驟(2)②獲得的對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH20稀釋20倍后，分別加入選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94°C預(yù)變性5min后，第一段循環(huán)為:94°C變性50s，65°C退火30s，每個循環(huán)降低0.7°C，72°C延伸2min, 12個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;第二段循環(huán)為:94°C變性50s，56。。退火30s，72°C延伸2min，23個循環(huán)，72°C延伸lOmin，4°C冷卻后，分別取出對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的選擇性擴(kuò)增引物由上游引物E-ACC和下游引物M-CAG組成，所述的上游引物E-ACC的堿基序列如SEQ ID NO:7所示，所述的下游引物M-CAG的堿基序列如SEQ ID NO:8所示；
[0014](3) AFLP-毛細(xì)管電泳檢測，將步驟(2)③獲得的對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上檢測，其上樣液甲酰胺10 μ 1，Sizestandard-6000.2 μ 1，稀釋 10 倍的 Sample3 μ I ；電壓 6KV,電流 4Ma,時間 50min ;選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，導(dǎo)出AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜；
[0015](4)結(jié)果分析與鑒別
[0016]根據(jù)步驟(3)導(dǎo)出的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜進(jìn)行分析，千山2號的特征峰為單一的一個峰，而且特征峰大小為119bp，當(dāng)待鑒別樣本的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜的特征峰為單一的一個峰，而且特征峰大小為119bp時，則該待鑒別樣本是燈盞花新品種千山2號，否則不是燈盞花新品種千山2號。
[0017]本發(fā)明還提供一種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的試劑組合物，該試劑組合物由限制性內(nèi)切酶EcoR 1、限制性內(nèi)切酶Mse 1、EcoR I接頭、Mse I接頭和T4連接酶、預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物組成；所述的EcoR I接頭的序列由A序列和B序列組成，所述的EcoR I接頭的A序列的堿基序列如SEQ ID N0:1所示，所述的EcoR I接頭的B序列的堿基序列如SEQ ID NO:2所示，所述的Mse I接頭的序列由C序列和D序列組成，所述的Mse I接頭的C序列的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，所述的Mse I接頭的D序列的堿基序列如SEQ ID NO:4所示；所述的預(yù)擴(kuò)增引物由上游引物E和下游引物M組成，所述的上游引物E的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，所述的下游引物M的堿基序列如SEQ ID NO:6所示；所述的選擇性擴(kuò)增引物由上游引物E-ACC和下游引物M-CAG組成，所述的上游引物E-ACC的堿基序列如SEQ ID NO:7所示，所述的下游引物M-CAG的堿基序列如SEQ ID NO:8所不。
[0018]本發(fā)明還提供上述試劑組合物在利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:
[0020]1、本發(fā)明經(jīng)過大量的試驗(yàn)成功篩選到能有效鑒別燈盞花新品種千山2號的限制性內(nèi)切酶、酶切產(chǎn)物接頭、預(yù)擴(kuò)增引物、選擇性擴(kuò)增引物、引物可擴(kuò)增出300多個位點(diǎn)，位點(diǎn)差異在Ibp都能檢測到，能容易、精確地檢測出樣本的細(xì)微差異。
[0021]2、本發(fā)明成功地建立了燈盞花新品種千山2號的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，能有效的鑒別待鑒別樣品是否是燈盞花新品種千山2號，為保護(hù)燈盞花乙素含量高的千山2號新品種提供了科學(xué)的依據(jù)。
[0022]3、本發(fā)明采用高效自動化技術(shù)，降低了人為操作帶來的誤差，易于對擴(kuò)增樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。
[0023]序列表中SEQ ID NO:1所示的是EcoR I接頭的A序列的堿基序列。
[0024]序列表中SEQ ID NO:2所示的是EcoR I接頭的B序列的堿基序列。
[0025]序列表中SEQ ID NO:3所示的是Mse I接頭的C序列的堿基序列。
[0026]序列表中SEQ ID NO:4所示的是Mse I接頭的D序列的堿基序列。
[0027]序列表中SEQ ID NO:5所示的是預(yù)擴(kuò)增引物的上游引物E的堿基序列。
[0028]序列表中SEQ ID NO:6所示的是預(yù)擴(kuò)增引物的下游引物M的堿基序列。
[0029]序列表中SEQ ID NO:7所示的是選擇性擴(kuò)增引物的上游引物E-ACC的堿基序列。[0030]序列表中SEQ ID NO:8所示的是選擇性擴(kuò)增引物的下游引物M-CAG的堿基序列?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0031]圖1是燈盞花新品種千山2號的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，橫坐標(biāo)表示片段長度(bp)，縱坐標(biāo)表示相對熒光單位(RFU)，*代表染色信號最高值(特征峰)，#代表染色信號次高值。
[0032]圖2是產(chǎn)于云南省昆明市松花壩的燈盞花的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，橫坐標(biāo)表示片段長度(bp)，縱坐標(biāo)表示相對熒光單位(RFU)，*代表染色信號最高值(特征峰)，#代表染色信號次高值。
[0033]圖3是產(chǎn)于云南省大理市的燈盞花的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，橫坐標(biāo)表示片段長度(bp)，縱坐標(biāo)表示相對熒光單位(RFU)，*代表染色信號最高值(特征峰)，#代表染色信號次高值。
[0034]圖4是產(chǎn)于云南省昆明市石林縣的燈盞花的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，橫坐標(biāo)表示片段長度(bp)，縱坐標(biāo)表示相對熒光單位(RFU)，*代表染色信號最高值(特征峰)，#代表染色信號次高值。
[0035] 圖5是產(chǎn)于云南省文山市丘北縣的燈盞花的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜，橫坐標(biāo)表示片段長度(bp)，縱坐標(biāo)表示相對熒光單位(RFU)，*代表染色信號最高值(特征峰)，#代表染色信號次高值。
【具體實(shí)施方式】
[0036]本發(fā)明收集了云南省燈盞花主要產(chǎn)區(qū)紅河哈尼族彝族自治州瀘西縣(千山2號)、大理市和文山市丘北縣及昆明市松花壩、昆明市石林縣四個地區(qū)的5種燈盞花，以千山2號為對照樣本，以產(chǎn)于大理市和文山市丘北縣及昆明市松花壩、昆明市石林縣的燈盞花為四個待鑒別樣本，用本發(fā)明進(jìn)行分子鑒別，快速、準(zhǔn)確地鑒別了待鑒別樣本是否為千山2號。
[0037]實(shí)施例
[0038]主要實(shí)驗(yàn)儀器:
[0039]CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter);臺式冷凍離心機(jī)(BeckmanCoulter);PCR 儀(MJ Research PTC200-well thermal cycler);紫外分光光度計(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝膠成像系統(tǒng)。
[0040]本發(fā)明方法除以下特殊說明外，均采用常規(guī)的AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)。各實(shí)施例中使用的各種試劑，均購自上海生工和寶生物公司。
[0041]本發(fā)明所述的一種燈盞花新品種千山2號的分子鑒別方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0042](I)樣本的收集:總共收集了 5個樣本，云南省燈盞花主要產(chǎn)區(qū)紅河哈尼族彝族自治州瀘西縣(千山2號)、大理市和文山市丘北縣及昆明市松花壩、昆明市石林縣四個地區(qū)的5種燈盞花，以千山2號為對照樣本，以產(chǎn)于大理市和文山市丘北縣及昆明市松花壩、昆明市石林縣的燈盞花為四個待鑒別樣本，每個樣本為15株植株。所述的5種燈盞花均可通過商業(yè)渠道購買或者野生采集得到。
[0043](2)樣本DNA的提取，以千山2號為對照樣本，分別取對照樣本和待鑒別樣本0.1g,分別按照CTAB法提取總DNA，總DNA經(jīng)RNA酶純化，并用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，OD值達(dá)到1.8-2.0，則該總DNA的純度符合后續(xù)鑒別要求，再將總DNA稀釋到200ng/ μ 1，即得對照樣本的DNA樣本和待鑒別樣本的DNA樣本；[0044](3) AFLP 擴(kuò)增
[0045]①DNA樣本的雙酶切及雙酶切產(chǎn)物的連接，分別將步驟(1)獲得的對照樣本的DNA樣本和待鑒別樣本的DNA樣本用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mse I雙酶切，在各雙酶切產(chǎn)物中加入EcoR I接頭、Mse I接頭和T4連接酶進(jìn)行連接，得到對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物，所述的EcoR I接頭的序列由A序列和B序列組成，所述的EcoR I接頭的A序列的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，所述的EcoR I接頭的B序列的堿基序列如SEQ IDNO:2所示，所述的Mse I接頭的序列由C序列和D序列組成，所述的Mse I接頭的C序列的喊基序列如SEQ ID NO:3所不，所述的Mse I接頭的D序列的喊基序列如SEQ ID NO:4所示；
[0046]②連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增，分別在步驟(2)①獲得的對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物中加入預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性35s，56°C退火40s，72°C延伸2min，共35個熱循環(huán)，4°C冷卻后，取出對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的預(yù)擴(kuò)增引物由上游引物E和下游引物M組成，所述的上游引物E的堿基序列如SEQ IDNO:5所示，所述的下游引物M的堿基序列如SEQ ID NO:6所示；(所述的預(yù)擴(kuò)增引物通過人工實(shí)驗(yàn)篩選得到)。
[0047]③選擇性擴(kuò)增，分別將步驟(2)②獲得的對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用滅菌的ddH20稀釋20倍后，分別加入選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94°C預(yù)變性5min后，第一段循環(huán)為:94°C變性50s，65°C退火30s，每個循環(huán)降低0.7°C，72°C延伸2min，12個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;第二段循環(huán)為:94°C變性50s，56°C退火30s，72°C延伸2min，23個循環(huán)，72°C延伸lOmin，4°C冷卻后，分別取出對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的選擇性擴(kuò)增引物對由上游引物E-ACC和下游引物M-CAG組成，所述的上游引物E-ACC的堿基序列如SEQ IDNO:7所示,所述的下游引物M-C`AG的堿基序列如SEQ ID NO:8所示；
[0048](4)AFLP_毛細(xì)管電泳檢測，將步驟③獲得的對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上完成檢測。其上樣液甲酰胺10 μ I, Sizestandard-6000.2 μ 1，稀釋10倍的待測樣品3 μ I ;電壓6KV，電流4Ma，時間50min ;擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過軟件自動統(tǒng)計分析并轉(zhuǎn)化為“0、1”，原始數(shù)據(jù)矩陣備用(作多態(tài)性分析)；同時，導(dǎo)出AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜。
[0049]結(jié)果與分析
[0050](I)擴(kuò)增結(jié)果
[0051]本發(fā)明方法共擴(kuò)增出可重復(fù)的312條帶，位點(diǎn)差異在Ibp都能檢測到，檢測出298個多態(tài)性(P=95.5%)，見表1，表明本發(fā)明方法能容易、精確地檢測出樣本的細(xì)微差異。
[0052]表1選擇性擴(kuò)增引物檢測效率
【權(quán)利要求】
1.一種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的方法，包括以下步驟: (1)樣本DNA的提取，以千山2號為對照樣本，分別取對照樣本和待鑒別樣本0.lg，分別按照CTAB法提取總DNA，總DNA經(jīng)RNA酶純化，并用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，OD值達(dá)到1.8-2.0,將總DNA稀釋到200ng/ μ 1，分別得對照DNA樣本和待鑒別DNA樣本； (2)AFLP 擴(kuò)增 ①DNA樣本的雙酶切及雙酶切產(chǎn)物的連接，分別將步驟(1)獲得的對照樣本的DNA樣本和待鑒別樣本的DNA樣本用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mse I雙酶切，在各雙酶切產(chǎn)物中加入EcoR I接頭、Mse I接頭和T4連接酶進(jìn)行連接，得到對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物，所述的EcoR I接頭的序列由A序列和B序列組成，所述的EcoR I接頭的A序列的喊基序列如SEQ ID NO:1所不，所述的EcoR I接頭的B序列的喊基序列如SEQ ID NO:2所不，所述的Mse I接頭的序列由C序列和D序列組成,所述的Mse I接頭的C序列的喊基序列如SEQ ID NO:3所不，所述的Mse I接頭的D序列的喊基序列如SEQ ID NO:4所不； ②連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增，分別在步驟(2)①獲得的對照樣本的連接產(chǎn)物和待鑒別樣本的連接產(chǎn)物中加入預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個循環(huán)941:變性358，561:退火40s，72°C延伸2min，共35個熱循環(huán)，4°C冷卻后，取出對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的預(yù)擴(kuò)增引物由上游引物E和下游引物M組成，所述的上游引物E的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，所述的下游引物M的堿基序列如SEQ ID NO:6所示； ③選擇性擴(kuò)增，分別將步驟(2)②獲得的對照樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH20稀釋20倍后，分別加入選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94°C預(yù)變性5min后，第一段循環(huán)為:94°C變性50s，65°C退火30s，每個循環(huán)降低0.7°C，72°C延伸2min, 12個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;第二段循環(huán)為:94°C變性50s，56。。退火30s，72°C延伸2min，23個循環(huán)，72°C延伸lOmin，4°C冷卻后，分別取出對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在_20°C保存；所述的選擇性擴(kuò)增引物由上游引物E-ACC和下游引物M-CAG組成，所述的上游引物E-ACC的堿基序列如SEQID NO:7所示，所述的下游引物M-CAG的堿基序列如SEQ ID NO:8所示； (3)AFLP-毛細(xì)管電泳檢測，將步驟(2)③獲得的對照樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物和待鑒別樣本的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上檢測，其上樣液甲酰胺10 μ 1，Sizestandard-6000.2 μ 1，稀釋 10 倍的 Sample3 μ I ;電壓 6KV,電流 4Ma,時間 50min ;選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管中電泳分離，導(dǎo)出AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜； (4)結(jié)果分析與鑒別 根據(jù)步驟(3)導(dǎo)出的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜進(jìn)行分析，當(dāng)待鑒別樣本的AFLP-毛細(xì)管電泳分離圖譜的特征峰為單一的一個峰，而且特征峰大小為119bp時，則該待鑒別樣本是燈盞花新品種千山2號，否則不是燈盞花新品種千山2號。
2.一種利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的試劑組合物，該試劑組合物由限制性內(nèi)切酶EcoR 1、限制性內(nèi)切酶Mse 1、EcoR I接頭、Mse I接頭和T4連接酶、預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物組成；所述的EcoR I接頭的序列由A序列和B序列組成，所述的EcoR I接頭的A序列的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，所述的EcoR I接頭的B序列的堿基序列如SEQ ID NO:2所示，所述的Mse I接頭的序列由C序列和D序列組成，所述的Mse I接頭的C序列的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，所述的Mse I接頭的D序列的堿基序列如SEQID NO:4所示；所述的預(yù)擴(kuò)增引物由上游引物E和下游引物M組成，所述的上游引物E的喊基序列如SEQ ID NO:5所不,所述的下游引物M的喊基序列如SEQ ID NO:6所示；所述的選擇性擴(kuò)增引物由上游引物E-ACC和下游引物M-CAG組成，所述的上游引物E-ACC的堿基序列如SEQ ID NO:7所示，所述的下游引物M-CAG的堿基序列如SEQ ID NO:8所示。
3.權(quán)利要求2所述的試劑組合物在利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒別燈盞花新品種千山2號的應(yīng)用 。
【文檔編號】G01N27/447GK103484542SQ201310410852
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】張廣輝, 楊生超, 張薇, 楊建文, 吳道聰, 龍光強(qiáng), 岳艷玲 申請人:紅河千山生物工程有限公司