專利名稱：一種改良的高靈敏高效的檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高靈敏高效的檢測轉(zhuǎn)基因小麥染色體的方法，本發(fā)明還涉及一個快速高效的獲取形態(tài)良好的中期分裂相的植物染色體的方法，屬于細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥是世界上重要的糧食作物之一，與社會經(jīng)濟發(fā)展、糧食安全供給和人類營養(yǎng)健康密切相關(guān)。遺傳基礎(chǔ)狹窄已經(jīng)成為制約作物品種單產(chǎn)水平、抗性、適應(yīng)性等重要農(nóng)藝性狀進一步提升的關(guān)鍵因素(葉興國et al.2011)?；蚬こ逃N作為雜交育種的主要補充手段，已經(jīng)在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中取得了巨大成功，基因工程賦予了這些作物本身所不具備的抗除草劑、抗蟲等一些優(yōu)良的性狀。在國家“863”計劃和“轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項”等科技項目的資助下，我國轉(zhuǎn)基因小麥研究尤其理論上取得了很大進展。隨著分子生物學(xué)和植物基因工程的不斷發(fā)展，越來越多的育種工作者開始利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得常規(guī)育種技術(shù)難以得到的新種質(zhì)和新品種。
檢測轉(zhuǎn)基因是否發(fā)生目前常用的方法主要有:PCR法，Southern雜交和熒光原位雜交(FISH)。PCR可以檢測目的基因是否整合在受體細胞的染色體上，PCR反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。同時對多位點插入難以檢測。檢測外源基因整合在植物染色體上最可靠的方法就是Southern雜交 和原位雜交。Southern雜交可檢測外源基因插入的拷貝數(shù)和插入方式，是一種較為精確的分析，Southern法準確性高、特異性強，但存在費時費力的缺點。另外，由于Southern法檢測不經(jīng)過靶片段的擴增(PCR)，一般每個電泳通道需要10-30 μ g的DNA，在實際操作中就需要較大量的植物材料來提取DNA，而轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織在無菌條件下經(jīng)過篩選、重新分化后一般都比較細弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時發(fā)生基因重組，造成限制性酶切位點丟失，Southern法也無法檢測到。這些因素都制約了 Southern法在TO代轉(zhuǎn)基因植物中檢測外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。
熒光原位雜交(FISH)是20世紀生物學(xué)領(lǐng)域的一項新技術(shù)，是一項利用標(biāo)記的DNA探針直接在染色體、間期核和DNA纖維上定位特定靶DNA序列的技術(shù)，具有較高的敏感性和特異性，已成為當(dāng)今細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段，廣泛應(yīng)用于植物學(xué)各方面的研究，例如植物基因的染色體物理作圖(Miller et al.1983 ；Mukai et al.1990)，雜種中親本染色體的鑒定，外源染色體或染色體片段的檢測(Schwarzacher et al.1989),物種進化及親緣關(guān)系的探討(Mukai et al.1993)，轉(zhuǎn)基因材料中外源基因的定位(Kenton etal.1995)等。尤其在檢測轉(zhuǎn)入基因及其表達產(chǎn)物方面有著明顯的優(yōu)勢，它不僅能檢測外源基因是否存在而且還能將外源基因直接定位在染色體的相應(yīng)位置，但由于轉(zhuǎn)化基因一般為小的單拷貝序列，所以對于轉(zhuǎn)基因植株的FISH分析技術(shù)要求較高，難度最大。需要優(yōu)良的染色體制片和高靈敏度的FISH操作程序(Harwood et al.2004)。
在植物FISH實驗中，傳統(tǒng)方法是取分裂旺盛的植物根尖，采用低溫處理或化學(xué)藥劑進行預(yù)處理，使染色體適當(dāng)凝縮、分散，然后進行壓片，壓片法是植物染色體制片的最常用的方法，也就是將經(jīng)過預(yù)處理的材料在卡諾固定液中固定后，用HCl或維素酶與果膠酶混合液解離，除去部分細胞壁和細胞質(zhì)，然后用45%的醋酸壓片，液氮冷凍揭去蓋玻片，但這種方法成功率較低，主要是因為壓片力度不好掌握，染色體很難完全散開，容易產(chǎn)生重疊、變形、斷裂等，此外未去除干凈的細胞質(zhì)及細胞壁對染色體的覆蓋，使原位雜交的信噪比增高。同時在揭片時可能由于玻片清潔度的原因，很容易將染色體揭掉，整個過程費時費力，且技術(shù)難度較大，很難獲得良好的染色體制片。由于其染色質(zhì)凝縮程度很高，細胞質(zhì)較厚，一般情況下分辨率為 5-lOMb (Pedersen and Linde-Laursen 1995),靈敏度為 IOkb 左右，對于大多數(shù)實驗室而言小于IOkb的基因檢出率很低(榮紅穎et al.2007)。金危危等(金危危et al.2001)利用減數(shù)分裂中期染色體制片對轉(zhuǎn)入水稻的大約4.Skb的外源基因進行了定位，檢出率為11.7-30.4%。植物減數(shù)分裂粗線期染色體的凝縮程度比中期染色體的低得多，其長度比相應(yīng)的中期染色體大7 50倍，使探針DNA容易進入，因而檢測靈敏度也有所提高。不過，選擇時期合適的用于制備粗線期染色體的花粉母細胞是很困難的，并且粗線期染色體很長，難以追溯和識別單個的染色體這些不利因素限制了粗線期FISH的應(yīng)用。小麥是異源六倍體，染色體數(shù)目是2n = 42，基因組龐大，重復(fù)序列多而復(fù)雜，對于外源染色體的追蹤和鑒定比較困難，我們參照Akio Kato等(Kato et al.2004)方法進行修改，根據(jù)不同的材料，處理不同的時間，得到最好狀態(tài)的染色體，對轉(zhuǎn)基因進行分析和精確的定位。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供高靈敏的檢測轉(zhuǎn)基因小麥的染色體的方法，其中靈敏度可達2-3kb。在第一方面中，本發(fā)明提供一種高靈敏的檢測轉(zhuǎn)基因小麥的染色體的方法，所述方法包括下述步驟:I)通過N2O氣體預(yù) 處理并酶解轉(zhuǎn)基因小麥和對照材料的根尖分生區(qū)細胞分裂旺盛的組織獲得圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相標(biāo)本；2)利用切口平移方法標(biāo)記所需檢測的目的片段的熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的所需檢測的目的片段的熒光探針對利用步驟I)轉(zhuǎn)基因小麥中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，和對照材料進行比對確定待檢測轉(zhuǎn)基因小麥中突光信號的分布。上述步驟中最關(guān)鍵的步驟是步驟I)能否獲得圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相標(biāo)本將影響對轉(zhuǎn)基因檢測的靈敏性。如上所述，步驟I)通過N2o(俗稱笑氣)預(yù)處理和酶解處理轉(zhuǎn)基因小麥和對照材料根尖分生區(qū)細胞，包括下述步驟:(a) N2O氣體預(yù)處理:取合適的根尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為lOATMd.0lMpa) ； (b)將隊0氣體預(yù)處理的根尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖用水洗滌，切下根尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min-2h。具體來說，笑氣預(yù)處理操作方法如下:
剪下合適的小麥根尖，放在濕潤的離心管里，笑氣(N2O)處理30分鐘至5小時，N2O的壓強為10ATM(1.0lMpa)，并將N2O預(yù)處理的根尖固定，以用于下一步的酶切處理。
根據(jù)植物種類不同，基因組大小不同，笑氣處理時間不同，比如花生、大豆等植物根尖或芽尖處理30-40分鐘，小麥、玉米等植物根尖或芽尖處理2小時，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖或芽尖處理時間可達到4-5小時。處理時間不當(dāng)過長或者過短都會影響染色體的制備。例如小麥的根尖或芽尖處理I個小時，染色體過長，一個細胞中的染色體會交疊在一起，影響后面的轉(zhuǎn)基因鑒定等試驗，梨的根尖或芽尖細胞處理1.5h，染色體會高度凝縮，甚至有的染色體會出現(xiàn)邊緣的絲狀，也會影響后面的實驗部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以需要根據(jù)植物基因組的大小、N2O的壓強等因素選擇合適的N2O處理時間。
其中，酶解根尖或芽尖的操作方法如下:
將經(jīng)過N2O預(yù)處理并且固定好的根尖或芽尖用水洗3次，洗去殘留的醋酸和酒精，用濾紙將根尖或芽尖上的水稍微吸干，將根尖或芽尖分生組織(約l_2mm)切下，放入果膠酶和纖維素酶的20μ L混合液中。根據(jù)植物基因組大小的不同，酶解時間也不相同，比如花生、大豆等植物根尖或芽尖酶解20-35分鐘，小麥、玉米等植物根尖或芽尖酶解48分鐘，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖或芽尖酶解時間可達到1-2個小時。酶解時間的把握也會直接影響染色體的制備以及后期的染色體的鑒定，比如小麥的染色體酶解40分鐘，酶解時間短，染色體就會呈現(xiàn)出細長，不規(guī)則的形態(tài)，如果酶解時間達到55分鐘甚至更長的時間，細胞中的染色體就會形態(tài)各異，大部分的染色體也不能完全分開，都得不到好的染色體從而對后期的鑒定工作帶來很多不便。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以需要根據(jù)植物基因組的大小等因素選擇合適的酶解時間。
在第二方面中，本發(fā)明還提供一種能夠快速高效的獲取形態(tài)良好的中期分裂相的植物染色體的方法，包括下述步驟:(a) N2O氣體預(yù)處理:取所述植物合適的根尖或芽尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為lOATMd.0lMpa) ； (b)將N2O氣體預(yù)處理的根尖或芽尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖或芽尖用水洗滌，切下根尖或芽尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min-2h。
具體地，所述能夠快速高效的獲取形態(tài)良好的中期分裂相的植物染色體的方法，包括下述步驟:
DN2O處理所述植物的根尖或芽尖分生區(qū)
將合適的根尖或芽尖放在濕`潤的離心管里，N20氣室中處理l_3h，壓強為IOATM(LOlMpa)；
2)根尖或芽尖固定
90%乙酸固定5-10分鐘(置于冰上，不超過Ih)，蒸餾水洗2次。
3)酶解
將根尖或芽尖分生組織切下，放入果膠酶和纖維素酶的中，37°C水浴。
4)滴片
用70%酒精洗掉酶解液，用解剖針將根尖搗碎，離心將酒精倒干，加入冰乙酸懸浮。
5)鏡檢
將干凈的載玻片放在濕潤的盒子中，每張載玻片滴6-7 μ I根尖或芽尖細胞懸浮液，蓋上盒蓋，5分鐘以后鏡檢。該染色體制備的方法適用的植物包括小麥(2η = 42)，短柄草(2η = 10，20，30)，海帶(η = 31),大豆(2η = 40),番爺(2η = 24),棉花(2η = 52),梨(2η = 34),百合(2η=24，36，60)，高粱(2η = 20)等雙子葉植物和單子葉植物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明提供一種高靈敏高效的檢測和鑒定小麥轉(zhuǎn)基因的方法，其包括下述步驟:I)利用本發(fā)明第二方面的方法制備轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料的有絲分裂中期分裂相；2)熒光標(biāo)記所述轉(zhuǎn)基因小麥所包含的目的基因，制成熒光探針；3)利用步驟2)標(biāo)記的熒光探針對轉(zhuǎn)基因小麥中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的 熒光原位雜交結(jié)果，確定待測植物中轉(zhuǎn)基因熒光信號的分布。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述待檢測的轉(zhuǎn)基因植株為TaDREB3轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料濟麥19。本發(fā)明的方法適用于制備不同植物的中期細胞染色體。特別地，本發(fā)明的方法首次成功地快速、高效、簡單方便的得到植物染色體，克服了現(xiàn)有技術(shù)中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術(shù)突破。具體地講，本發(fā)明的方法有以下幾點技術(shù)突破:1)染色體制片技術(shù)的改進，本發(fā)明的方法采用了笑氣(N2O)對根尖或芽尖預(yù)處理，而非傳統(tǒng)的化學(xué)試劑秋水仙素、八羥基喹啉、對二氯苯等化學(xué)試劑，主要優(yōu)點體現(xiàn)在無毒害、分散效果好，同時也掌握了笑氣(N2O)處理時間長短對后續(xù)染色體制備的影響；2)對根尖或芽尖分生區(qū)細胞酶切處理，掌握了不同酶切處理時間長短對后續(xù)染色體制備的影響，這主要是跟基因組大小有關(guān)；3)熒光探針構(gòu)建及熒光原位雜交技術(shù)與同類方法相比較也體現(xiàn)了快捷、高效、信號強等特點；雖然上述技術(shù)中的一種或幾種在相關(guān)的研究中得到了應(yīng)用，但是綜合應(yīng)用這樣幾種技術(shù)構(gòu)成完整的實驗方案，并應(yīng)用到聞靈敏聞效檢測小麥轉(zhuǎn)基因未見到相關(guān)研究報道。本發(fā)明首次利用該套研究方案成功地以高靈敏度檢測轉(zhuǎn)基因小麥，克服了現(xiàn)有技術(shù)中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術(shù)突破，體現(xiàn)了該研究方法具有較好的先進性、創(chuàng)新性和實用性。綜上所述，本發(fā)明提供下列各項:1.一種高靈敏高效的檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其包括下述步驟:I)通過N2O氣體預(yù)處理并酶解轉(zhuǎn)基因小麥和對照材料的根尖分生區(qū)細胞分裂旺盛的組織獲得圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相標(biāo)本；2)利用切口平移方法標(biāo)記所需檢測的目的片段的熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的所需檢測的目的片段的熒光探針對利用步驟I)轉(zhuǎn)基因小麥中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，和對照材料進行比對確定待檢測轉(zhuǎn)基因小麥中突光信號的分布。2.第I項所述的方法，其中步驟I)包括下述步驟:(a)N20氣體預(yù)處理:取合適的小麥根尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為lOATMd.0lMpa) ； (b)將隊0氣體預(yù)處理的根尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖用水洗滌，切下根尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min-2h。
3.第I項所述的方法，其中步驟2)通過酶切分離轉(zhuǎn)基因載體中的目的片段，借助切口平移方法對目的基因擴增產(chǎn)物進行熒光探針標(biāo)記，所述目的片段為轉(zhuǎn)基因載體攜帶的基因片段。
4.一種獲取形態(tài)良好的中期分裂相的植物染色體的方法，所述方法包括下述步驟:
(a) N2O氣體預(yù)處理:取所述植物合適的根尖或芽尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為10ATM(1.0lMpa) ； (b)將N2O氣體預(yù)處理的根尖或芽尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖或芽尖用水洗滌，切下根尖或芽尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min_2h。
5.第4項所述的方法，其中所述植物包括單子葉植物或雙子葉植物。
6.第4項所述的方法，其中所述植物選自小麥、短柄草、海帶、大豆、番茄、棉花、梨、百合或高粱。
從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中:
圖1顯示小麥轉(zhuǎn)基因信號的染色體定位:
圖1A，對照材料濟麥19細胞中期分裂相，細胞中42條小麥染色體，為本實驗的陰性對照；圖1B:Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥細胞中期分裂相，箭頭示轉(zhuǎn)基因信號，位于同源染色體的端部，探針?biāo)媚康钠伍L度為1264bp，其靈敏性可達到2kb左右，綠色熒光信號在顯微鏡下清晰可見。
圖2顯示不 同植物的中期染色體，A，大豆(2n = 40)，B，棉花(2n = 52)，C，水稻(2n = 24) ,D,海帶孢子體(2n = 62), E,高粱(2n = 20)，F(xiàn)，短柄草(2n = 10) ,G,百合(2n=36)，H，梨(2n = 34)，I，番茄(2n = 24)。
圖3顯示不同笑氣處理時間的中期染色體:
圖3A，普通小麥根尖處理I小時的條件制備的中期細胞染色體，染色體過長，一個細胞中的染色體會交疊在一起。圖3B，普通小麥根尖處理2小時的條件制備的中期細胞染色體，染色體清晰可見，辨識清楚。圖3C，梨的根尖細胞處理1:30h，染色體會高度凝縮，甚至有的染色體會出現(xiàn)邊緣的絲狀。
圖4顯示不同酶解時間的中期染色體:
圖4A，小麥的染色體酶解40m，酶解時間短，染色體就會呈現(xiàn)出細長，不規(guī)則的形態(tài)。圖4B，小麥根尖細胞酶解時間達到55m甚至更長的時間，細胞中的染色體就會形態(tài)各異，大部分的染色體交疊在一起，不能完全辨識。圖4C，梨根尖細胞酶解30m，時間短，染色體會出現(xiàn)邊緣絲狀，不能完全辨識。
具體實施方式
下面參考實施例和附圖詳細描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，下述實施例是舉例說明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護范圍由后附的權(quán)利要求所限定。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，除非另外具體說明，下述實施例中所用的試劑均為市售分析純級別的試劑。實施例1.Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料濟麥19熒光原位雜交的鑒定1.轉(zhuǎn)基因小麥有絲分裂中期分裂相的制備所用Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料濟麥19，來自中國農(nóng)科院馬有志實驗室提供(XiaoYan H, Ming C, HuiJun X, ShiQing G, XianGuo C, LianCheng L, LiPu D, XinGuoY, YouZhi M(2005)Obtaining of transgenic wheats with GH-DREB gene and theirphysiological index analysis on drought tolerance.Southwest China Journal ofAgricultural Sciences 18:616-620)。DN2O處理根尖待根尖長到2-3cm時，剪下，放在濕潤的離心管里，蓋上蓋子后放入N20氣室中處理 l_3h，壓強為 IOATM (1.0lMpa)；2)根尖固定90%乙酸固定5-10分鐘(不超過Ih)，蒸餾水洗2次。固定后的根尖可轉(zhuǎn)入70%的乙醇中放入_20°C可保存多年；3)酶解用濾紙將根尖上的水稍微吸干，將根尖分生組織切下，放入果膠酶和纖維素酶的20 μ L混合液(酶解液配制:把一個塑料培養(yǎng)皿放到天平上，向里面加入I X檸檬酸緩沖液(IOmM檸檬酸鈉+IOmM EDTA, pH 5.5)9.7g，取出置于冰上，稱取0.1g果膠酶Y-23 (購自日本 Japan Yakult 公司，I % w/w)和 0.2g 纖維素酶 Onozuka R-10 (購自日本 Japan Yakult公司，2% w/w)加入緩沖液中，用槍頭吹吸助溶，酶溶解后用分液器分裝到0.5ml薄壁PCR管中，_20°C保存)中，37°C水浴40-60分鐘，4)滴片用70%酒精洗2次，洗第二次時留一點酒精，大約200ul在離心管里，用解剖針將根尖搗碎，低速(< 2000轉(zhuǎn))離心10秒左右，將酒精倒干，加冰乙酸(每個根尖20-40 μ 1，視植物根尖大小)懸浮根尖細胞。5)鏡檢將干凈的載玻片放在濕潤的盒子中，每張載玻片滴6-7 μ I根尖細胞懸浮液，蓋上盒蓋，5分鐘以后鏡檢，將染色體制片標(biāo)本保存在冰箱中備用。2.Ta DREB3目的基因的探針標(biāo)記I)將下列組分在冰上加入離心管中
Ta DREB3 目的基因 DNA 2μ g(200ng/u I) Ι Ομ I IOx Nick 緩沖液2.0μ1
標(biāo)記的-dNTP(ImM)0.5μ I
未標(biāo)記的dNTPs (每種2mM，混合的)_2.0 μ I
DNA 聚合酶 I (10U/μ I)5.0μ I
DNase lClOOmU/μ I)|θ.5μ I其中Ta DREB3 (SEQ ID N0.1，GenBank:FJ560494.1)利用酶切從轉(zhuǎn)基因載體上切下，濃度為200ng/y 1，上述各種組分加好后，用槍頭反復(fù)吹打混勻，不能渦旋，15°C保溫2小時。置于金屬浴儀(H203-PR0，中國)中15°C反應(yīng)2h。(標(biāo)記的-dNTP為AlexaFluor-488-dUTP (綠光)，購自Invitrogen公司；DNA聚合酶I購自Invitrogen公司，濃度為IOU/μ L，可直接使用，IOx Nick緩沖液:100ml緩沖液中包含Tris 6.05g，MgCl2，0.47g，用 HCl 調(diào) pH 7.8)；
2) 13000轉(zhuǎn)離心30_40分鐘，棄上清液，分別用70%乙醇和無水乙醇洗一次沉淀，避光晾干。
3)力口 10 μ I 2 X SSC, I X TE 緩沖液(pH 7.0)，使探針終濃度為 200ng/ul。
3.利用標(biāo)記好的Ta DREB3目的基因的探針對Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料濟麥19進行熒光原位雜交的鑒定
I)用程序I的方法制備Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥與對照材料濟麥19 (來自中國農(nóng)科院馬有志實驗室)中期染色體標(biāo)本。
2)將待雜交標(biāo)本(制片)放入紫外交聯(lián)儀(code-N0.CL-1000，購自美國UVP公司)中0.125J/cm2交聯(lián)。
3)用 2 X SSC (0.3mol/L NaCl，0.03mol/L 檸檬酸鈉)，I X TE 緩沖液(10mmol/LTris-HCl, lmmol/L EDTA，pH 8.0)稀釋探針，不同的探針稀釋比例不同，一般I: 5-1: 10稀釋。
4)將制片放在冰上，加5-6 μ L雜交液，蓋上塑料蓋玻片，放入小鐵盆中(鐵盆中墊有吸水紙，用水噴濕)，用塑料盒子蓋上，放入沸水中5min，然后放入已預(yù)熱的濕盒中55°C雜交過夜。
5)將制片從濕盒中取出，放入2XSSC中使蓋玻片滑落，用吸水紙把片子背面擦干，滴上一滴含DAPI的抗淬滅劑(H-1200，購自美國Vector Labs公司)，蓋上24X50_的蓋玻片，數(shù)分鐘后即可用突光顯微鏡(Olympus BX61)進行鏡檢、照相(Magnafier (XDcamera)。
4.結(jié)果和討論
研究結(jié)果見圖1。
如圖1A所示，對照材料濟麥19細胞中期分裂相，細胞中42條小麥染色體可以清晰進行辨認，綠色通道是探針信號，即使曝光很強，綠色探針也沒有熒光信號，為本實驗的陰性對照；圖1B所示:Ta DREB3轉(zhuǎn)基因小麥細胞中期分裂相，箭頭示轉(zhuǎn)基因信號，位于同源染色體的端部，探針?biāo)媚康钠伍L度為1264bp，其靈敏性可達到2kb左右，綠色熒光信號在顯微鏡下清晰可見，在染色體上直觀清楚，確認為轉(zhuǎn)基因陽性植株，為后續(xù)生物學(xué)實驗提供基礎(chǔ)。本次試驗生物學(xué)重復(fù)三次，均為一致的結(jié)果。
本研究首次利用2kb左右的目的基因PCR擴增產(chǎn)物作為熒光探針，對轉(zhuǎn)基因小麥進行鑒定，結(jié)果顯示信號非常清晰，表明利用本發(fā)明采用的方法成功檢測和鑒定了轉(zhuǎn)基因小麥陽性植株，本實驗從發(fā)種子到鑒定結(jié)束只是需要3天時間，不僅高效而且靈敏，靈敏度可達到2-3kb。
實施例2.不同植物的中期染色體制備
1.種子萌發(fā)
(I)將多種植物的種子分別放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，21_23°C恒溫箱中萌發(fā)。2.植物染色體標(biāo)本制備I)同實施例1.1。待根尖長到2-3cm時，剪下，放在濕潤的離心管里，笑氣處理30分鐘至5小時，根據(jù)植物種類不同，基因組大小不同，笑氣處理時間不同，比如花生、大豆等植物根尖處理30-40分鐘，小麥、玉米等植物根尖處理2小時，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖處理時間可達到4-5小時。2)同實施例1.2。3)同實施例1.3。4)同實施例1.4。用濾紙將根尖上的水稍微吸干，將根尖分生組織切下，放入果膠酶和纖維素酶的混合液中，37°C水浴40-80分鐘，根據(jù)植物基因組大小的不同，酶解時間也不相同，比如花生、大豆等植物根尖酶解20-35分鐘，小麥、玉米等植物根尖酶解48分鐘，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖酶解時間可達到1-2個小時。5)同實施例1.5。3.結(jié)果和討論研究結(jié)果見圖2，圖3和圖4。如圖2所示，大豆(2n = 40),棉花(2n = 52),水稻(2n = 24)，海帶孢子體(2n =62)，高粱(2n = 20)，短柄草(2n = 10),百合(2n = 36),梨(2n = 34)，番爺(2n = 24)等單子葉植物和雙子葉植物的中期細胞染色體，染色體形態(tài)呈棒狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)明顯的著絲粒，清晰可見，方便后續(xù)的實驗。
研究結(jié)果見圖3和圖4。圖3A，普通小麥根尖處理I小時的條件制備的中期細胞染色體，染色體過長，一個細胞中的染色體會交疊在一起。圖3B，普通小麥根尖處理2小時的條件制備的中期細胞染色體，染色體清晰可見，辨識清楚。圖3C，梨的根尖細胞處理1:30h，染色體會高度凝縮，甚至有的染色體會出現(xiàn)邊緣的絲狀。處理時間不當(dāng)過長或者過短都會影響染色體的制備，根據(jù)植物種類不同，基因組大小不同，笑氣處理時間不同，比如花生、大豆等植物根尖處理30-40分鐘，小麥、玉米等植物根尖處理2小時，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖處理時間可達到4-5小時。圖4A，小麥的染色體酶解40分鐘，酶解時間短，染色體就會呈現(xiàn)出細長，不規(guī)則的形態(tài)。圖4B，小麥根尖細胞酶解時間達到55分鐘甚至更長的時間，細胞中的染色體就會形態(tài)各異，大部分的染色體交疊在一起，不能完全辨識。圖4C，梨根尖細胞酶解30分鐘，時間短，染色體會出現(xiàn)邊緣絲狀，不能完全辨識。酶解時間的把握直接影響染色體的制備以及后期的染色體的鑒定。根據(jù)植物基因組大小的不同，酶解時間也不相同，比如花生、大豆等植物根尖酶解20-35分鐘，小麥、玉米等植物根尖酶解48分鐘，而對于像百合這樣的大基因組植物根尖酶解時間可達到1-2個小時。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。參考文獻Harwood WA, BiIham LJ, Travella S, Salvo-Garrido H, Snape Jff(2004)Fluorescence in situ hybridization to localize transgenes in plantchromosomes.METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN T0T0WA-286:327-340
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權(quán)利要求
1.一種高靈敏高效的檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其包括下述步驟: 1)通過N2O氣體預(yù)處理并酶解轉(zhuǎn)基因小麥和對照材料的根尖分生區(qū)細胞分裂旺盛的組織獲得圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相標(biāo)本； 2)利用切口平移方法標(biāo)記所需檢測的目的片段的熒光探針； 3)利用步驟2)構(gòu)建的所需檢測的目的片段的熒光探針對利用步驟I)轉(zhuǎn)基因小麥中期分裂相染色體進行熒光原位雜交； 4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，和對照材料進行比對確定待檢測轉(zhuǎn)基因小麥中突光信號的分布。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟I)包括下述步驟:(a)N20氣體預(yù)處理:取合適的根尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為lOATMd.0lMpa) ； (b)將隊0氣體預(yù)處理的根尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖用水洗滌，切下根尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min-2h。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)通過酶切分離轉(zhuǎn)基因載體中的目的片段，借助切口平移方法對目的基因擴增產(chǎn)物進行熒光探針標(biāo)記，所述目的片段為轉(zhuǎn)基因載體攜帶的基因片段。
4.一種獲取形態(tài)良好的中期分裂相的植物染色體的方法，所述方法包括下述步驟: (a) N2O氣體預(yù)處理:取所述植物合適的根尖或芽尖，放在濕潤的離心管里，放入N2O氣室中處理0.5-5小時，N2O的壓強為10ATM(1.0lMpa) ； (b)將N2O氣體預(yù)處理的根尖或芽尖固定；(c)酶解處理:將固定好的根尖或芽尖用水洗滌，切下根尖或芽尖分生組織，用果膠酶和纖維素酶處理30min-2h。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物包括單子葉植物或雙子葉植物。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物選自小麥、短柄草、海帶、大豆、番茄、棉花、梨、百合或高粱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良的高靈敏高效的檢測和鑒定小麥轉(zhuǎn)基因的方法，所述方法包括下述步驟1)通過N2O氣體預(yù)處理并酶解小麥根尖分生區(qū)細胞分裂旺盛的組織獲得圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相標(biāo)本；2)利用切口平移方法標(biāo)記所需檢測目的片段(例如，轉(zhuǎn)基因載體攜帶的轉(zhuǎn)基因片段)的熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體目的片段的熒光探針對利用步驟1)轉(zhuǎn)基因小麥中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，和對照材料進行比對確定待檢測轉(zhuǎn)基因小麥中熒光信號的分布。利用本發(fā)明提供的方法不但可以應(yīng)用到小麥外源轉(zhuǎn)基因的染色體定位，其中靈敏度可達2-3kb，也可以應(yīng)用到對其他農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因信號鑒定工作中。
文檔編號G01N21/64GK103160612SQ201310127449
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者韓方普, 呂振玲, 符書蘭 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
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