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一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀，包括微流控芯片系統(tǒng)、熒光光源系統(tǒng)和分析計數(shù)系統(tǒng)；所述的微流控芯片系統(tǒng)包括微流控芯片(3)、計算機(jī)控制的控制器(18)和管道(20)；所述的熒光成像系統(tǒng)包括激光器A(9)、激光器B(12)、熒光探測的物鏡(8)、和信號處理的攝像機(jī)(17)；所述的分析計數(shù)系統(tǒng)包含計算機(jī)(19)。本發(fā)明將所述微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀結(jié)合磁性細(xì)胞分選技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，用于結(jié)腸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測，通過微流控分析計數(shù)系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析、計數(shù)，實現(xiàn)細(xì)胞計數(shù)及形態(tài)的分析。
【專利說明】一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于流式細(xì)胞檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于微流控芯片的多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀。

【背景技術(shù)】
[0002]循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指從原位瘤脫離出來并進(jìn)入血液循環(huán)的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有在機(jī)體內(nèi)其它部位附著并形成新的癌轉(zhuǎn)移灶的潛能。CTC在多種癌癥患者體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，其具有原發(fā)灶細(xì)胞的生物學(xué)特征，可在機(jī)體淺表的外周血中檢出，被認(rèn)為在反映癌癥惡性程度及預(yù)后方面具有重要的應(yīng)用價值，其數(shù)量的統(tǒng)計有可能成為判斷癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后的重要指標(biāo)。因此，如何高效、快速、準(zhǔn)確的對獲取的CTCs進(jìn)行計數(shù)分析已成為基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞為主的癌癥診斷系統(tǒng)研發(fā)和應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。
[0003]—般獲取CTC的方法是使用免疫磁球?qū)ρ褐械腃TC進(jìn)行捕獲，磁分離后，對捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記分析。其基本原理是使用特異性的熒光染料對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光顯微鏡中的熒光激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，檢測熒光標(biāo)記后靜態(tài)或動態(tài)細(xì)胞的熒光信號，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。一般的熒光細(xì)胞計數(shù)儀能自動檢測和計數(shù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，雖然這些儀器已具有強(qiáng)大功能，但其也存在一些需要改進(jìn)的地方。首先，儀器中的熒光計數(shù)裝置的相關(guān)設(shè)備需要與CTCs磁分離捕獲裝置配合使用，這無疑增加了儀器本身及相應(yīng)組件的成本，使其較難普及應(yīng)用；第二，捕獲CTC的免疫磁球僅采用單一的抗EpCAM抗體修飾，免疫磁球的單一性嚴(yán)重影響了其對復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。第三，儀器中的熒光計數(shù)裝置需要通過人工計數(shù)熒光染色的細(xì)胞個數(shù)，人工計數(shù)不但增加了樣品分析的時間，且在一定程度上降低了計數(shù)的穩(wěn)定性和一致性。因此，市場及臨床迫切需要一種價格低廉，具有自主研發(fā)優(yōu)勢，并且可以很好的靈活應(yīng)用于普通消費(fèi)群體的CTCs熒光分析及評判裝置。
[0004]微流控芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的學(xué)科，是指操作微小網(wǎng)絡(luò)通道(5-500微米)中流體的科學(xué)技術(shù)。微流控芯片是基于大規(guī)模平行處理生物信息分子原理的微型裝置，可傳輸微升(UL)到納升(nL)甚至皮升(pL)量級的流體，并將生化反應(yīng)的若干步驟包括分析、洗滌、檢測等集成在一塊或幾塊微流體芯片上，具有信息通量大、自動化、系統(tǒng)化的特點。微流控芯片具有可集成化、易自動化操作的特點使其與常規(guī)生物分析相比有很多潛在的優(yōu)勢，在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域有著越來越多的應(yīng)用。目前以微流控芯片為基礎(chǔ)的儀器例如PCR，蛋白結(jié)晶儀，DNA測試儀都已經(jīng)相繼問世。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題提供一種熒光標(biāo)記后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的快速準(zhǔn)確計數(shù)的儀器，填補(bǔ)結(jié)合微流控芯片技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，進(jìn)行準(zhǔn)確的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測和分析的技術(shù)空白。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀，包括微流控芯片系統(tǒng)、熒光光源系統(tǒng)和分析計數(shù)系統(tǒng)；所述的微流控芯片系統(tǒng)包括微流控芯片、計算機(jī)控制的控制器和管道；所述的熒光光源系統(tǒng)包括兩種或以上激光器，如激光器A和激光器B、熒光探測的物鏡、和信號處理的攝像機(jī)；所述的分析計數(shù)系統(tǒng)包含計算機(jī)。
[0009]上述的技術(shù)方案的優(yōu)選方式之一為，所述的微流控芯片系統(tǒng)還可選地含有、載物臺、電機(jī)、導(dǎo)軌和絲桿之一或以上。
[0010]上述的技術(shù)方案的優(yōu)選方式之二為，所述的熒光成像系統(tǒng)還可選地含有照明光源、聚光鏡、物鏡、擴(kuò)束鏡A、二向色鏡1、擴(kuò)束鏡B、二向色鏡2、濾光片轉(zhuǎn)輪之一或以上。
[0011]上述的技術(shù)方案的優(yōu)選方式之三為，所述的物鏡優(yōu)選40倍光學(xué)物鏡，所述的激光器A優(yōu)選405nm,所述的激光器B優(yōu)選488nm。
[0012]上述的技術(shù)方案的優(yōu)選方式之四為，所述的微流控芯片的材質(zhì)為硅酮；具有三維結(jié)構(gòu)；芯片厚度小于50微米；芯片內(nèi)樣品容量小于10微升；芯片表面采用EpCAM抗體修飾。
[0013]上述的技術(shù)方案的優(yōu)選方式之五為,所述的突光光源系統(tǒng)設(shè)兩種突光激發(fā)光源；所述激光器(A)熒光激發(fā)光源激發(fā)被4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的細(xì)胞，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；所述激光器(B)熒光激發(fā)光源激發(fā)被異硫氰酸熒光素(FITC)和藻紅蛋白(PE)染色的細(xì)胞，分別產(chǎn)生綠色熒光和紅光熒光。
[0014]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的制備方法，包括以如下步驟制備微流控芯片，
[0015]I)旋涂光刻膠于硅片表面，固化，紫外曝光后顯影，制作微流控芯片模板；
[0016]2)硅酮(PDMS)按A:B為5:1混合，在真空中脫氣，倒入置有模具的培養(yǎng)皿中，倒膠厚度5毫米，80°C加熱固化60min后將PDMS與模具分離；
[0017]3)打孔，將上下兩層PDMS對準(zhǔn)，粘合；80°C烘烤I小時。
[0018]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三為上述的細(xì)胞計數(shù)儀用于血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的計數(shù)和圖像分析。
[0019]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四為上述的細(xì)胞計數(shù)儀用于結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)。
[0020]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五為上述的細(xì)胞計數(shù)儀的應(yīng)用，包括預(yù)先進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞磁分離及鑒定；或者，包括在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及熒光標(biāo)記狀態(tài)分析。
[0021]所述的微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀用于對樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和分析；
[0022]所述的熒光光源系統(tǒng)用于對微流控芯片上的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)、拍照和細(xì)胞計數(shù)；包含一個靠近微流控芯片的光源裝置，設(shè)三種熒光激發(fā)光源，DAPI藍(lán)光、FITC綠光和PE紅光；一個靠近所述微流控芯片和所述光源裝置的熒光探測裝置；一個與熒光檢測裝置相連的信號處理器。
[0023]所述的分析計數(shù)系統(tǒng)包含軟件及計算機(jī)控制模塊，用于熒光圖像的采集及腫瘤細(xì)胞的自動計數(shù)及自動分析產(chǎn)生數(shù)據(jù)。
[0024]本發(fā)明的多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀設(shè)置有計算機(jī)接口，通過計算機(jī)對分析計數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行控制。
[0025]本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞熒光檢測儀關(guān)鍵光學(xué)部分可選擇萬能無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)。光線通過無限遠(yuǎn)色差校正物鏡后成為平行光束，該平行光束經(jīng)管鏡成像到CCD感光芯片。物鏡與管鏡之間可添加光學(xué)附件而不影響總放大倍數(shù)。
[0026]本發(fā)明所述的微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的應(yīng)用包括血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的計數(shù)和圖像分析，使用時需配合相應(yīng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞磁分離及鑒定系統(tǒng)；另外還包含微流控芯片內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)及熒光標(biāo)記狀態(tài)分析。
[0027]有益效果
[0028]I)本發(fā)明結(jié)合微流控芯片技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和多色熒光分析技術(shù)對細(xì)胞特別是循環(huán)腫瘤細(xì)胞的個數(shù)進(jìn)行自動統(tǒng)計，同時對細(xì)胞的微觀形態(tài)進(jìn)行圖像的采集和分析，并可進(jìn)一步實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞在分子及基因方面的分析，結(jié)果可靠性高；
[0029]2)另一方面，利用分析計數(shù)裝置進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與計數(shù)，減少人工操作時間和處理程序。
[0030]3)與本發(fā)明的微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀配套使用的細(xì)胞抓捕系統(tǒng)包含的免疫磁性微球技術(shù)是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種微球進(jìn)行免疫學(xué)或其它生物學(xué)檢測的新技術(shù)；此項技術(shù)由于具有快捷、簡便、分離純度高等優(yōu)點已被廣泛使用到各個領(lǐng)域并已取得巨大進(jìn)展。
[0031]本發(fā)明中所涉及的微流控芯片具有以下特點:
[0032]A.利用微流控芯片對微米尺度流體中細(xì)胞的精確操控能力，可對加入芯片的CTC細(xì)胞進(jìn)行精確操作，通過微流控芯片的準(zhǔn)確設(shè)計，實現(xiàn)芯片中CTC單細(xì)胞層；
[0033]B.微流控芯片的三維結(jié)構(gòu)設(shè)計，不但實現(xiàn)芯片內(nèi)單細(xì)胞層，而且維持芯片的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(芯片中條形骨架結(jié)構(gòu))，同時設(shè)計特殊標(biāo)記，方便多色熒光分析儀器的精確定位分析CTC細(xì)胞。
[0034]C.結(jié)合多色熒光分析儀器，來實現(xiàn)單個細(xì)胞的熒光分析和快速計數(shù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是本發(fā)明專利的工作流程示意圖。圖例:照明光源(I)、聚光鏡(2)、微流控芯片⑶、載物臺(4)、電機(jī)(5)、導(dǎo)軌(6)、絲桿(7)、物鏡(8)(優(yōu)選40倍)、激光器A(9)、(優(yōu)選405nm)擴(kuò)束鏡A (10)、二向色鏡I (11)、激光器B (12)(優(yōu)選488nm)、擴(kuò)束鏡B (13)、二向色鏡2 (14)、濾光片轉(zhuǎn)輪(15)、管鏡(16)、攝像機(jī)(17)、控制器(18)、計算機(jī)(19)、管道(20)；
[0036]圖2是微流控芯片(3)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0037]圖3是在微流控芯片(3)上讀取的進(jìn)行免疫染色后的細(xì)胞熒光顯微鏡圖像。

【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0039]實施例1
[0040](I)結(jié)直腸癌CTC的捕獲及熒光標(biāo)記
[0041]采用外周血CTC高精度分離試劑盒(上海柏慧康生物科技有限公司)對外周血中結(jié)直腸癌細(xì)胞(復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，10份，每份5.0mL)進(jìn)行捕獲及熒光標(biāo)記。對結(jié)直腸癌細(xì)胞的模擬捕獲實驗分為兩個過程，首先將結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞與其它正常細(xì)胞(293T細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)))共混驗證外周血CTC高精度分離試劑盒對CTC細(xì)胞的分離功能，同時與微流控多色熒光CTC計數(shù)儀對接；其次，對獲取的結(jié)直腸癌患者外周血進(jìn)行CTC捕獲鑒定試驗。
[0042]其中磁分離及染色的具體過程為:提取5.0mL外周血樣本，800轉(zhuǎn)/分離心分離后，抽取上層血清混合液；加入50 μ L標(biāo)記抗-EpCAM抗體(美國Sigma公司)的鐵磁流體(質(zhì)量濃度0.5% )和2.0mL磷酸鹽緩沖液(濃度0.lmol/L);磁性孵育；磁性分離抽取未標(biāo)記細(xì)胞；再次懸浮在磷酸鹽緩沖液中，分別加入DAPI染色液(碧云天生物)、CK19染色液(Eb1science，貨號 53-9898-82)和 CD45 染色液(Eb1science，貨號 12-0459-42)賦予染色15min，分別磁性分離收集染色后的細(xì)胞。
[0043]標(biāo)記熒光染色試劑的細(xì)胞一抗-CK-PE識別細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞角質(zhì)蛋白8、18和/或19 ;DAPI將細(xì)胞核物質(zhì)染色；抗-CD45-APC識別白血球；對染色后的CTC細(xì)胞進(jìn)行磁分離洗滌以備后續(xù)使用。其中，熒光染色采用三種熒光試劑分別為DAPI染核(藍(lán)光)，PE-抗CD45標(biāo)記白細(xì)胞(紅光)，F(xiàn)ITC-抗CK蛋白標(biāo)記上皮腫瘤細(xì)胞(綠光)。
[0044]控制最后微流控多色熒光CTC檢測儀的進(jìn)樣量為5 μ L，固體物質(zhì)含量彡0.5%。
[0045](2)微流控芯片3的構(gòu)建
[0046]微流控芯片3主要是利用微流控芯片對微米尺度流體中微小物體(細(xì)胞)的精確操控能力對加入芯片的CTC細(xì)胞進(jìn)行精確操作，通過微流控芯片的準(zhǔn)確設(shè)計，實現(xiàn)芯片中CTC單細(xì)胞層，結(jié)合多色熒光分析儀器，來實現(xiàn)單個細(xì)胞的熒光分析和快速計數(shù)。
[0047]微流控芯片3將采用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕技術(shù)(softlithography),旋涂光刻膠于娃片表面，固化，紫外曝光后顯影，制作微流控芯片模板。硅酮(PDMS)(國藥化學(xué)試劑有限公司)按A:B為5:1混合，并在真空中脫氣，倒入置有模具的培養(yǎng)皿中，倒膠厚度5毫米，80°C加熱固化60min后將PDMS與模具分離。打孔，將上下兩層PDMS對準(zhǔn)，粘合。80°C烘烤I小時。微流控芯片3包括管道20(包括內(nèi)壁立體圖案修飾)、進(jìn)樣口、出樣口等部分組成，管道20內(nèi)壁一側(cè)或雙側(cè)進(jìn)行表面修飾。進(jìn)樣、洗滌、轉(zhuǎn)移和出樣都由微型電磁閥通過控制系統(tǒng)的編程數(shù)碼操作，進(jìn)樣量由微型計量泵和芯片內(nèi)置閥門系統(tǒng)精確控制。
[0048](3)微流控多色熒光CTC檢測儀的構(gòu)建
[0049]微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的熒光光源系統(tǒng)包含微流控芯片3 (單細(xì)胞層覆蓋)及進(jìn)樣裝置；一個靠近微流控芯片3的光源I裝置；一個靠近所述微流控芯片3和所述光源I裝置的熒光探測裝置；一個與熒光檢測裝置相連的信號處理器。其中的微流控裝置上覆蓋以進(jìn)行熒光標(biāo)記的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞通過過程中可被來自所述光源列的光束撞擊，并因此發(fā)出熒光信號；這些不同的熒光信號會返回到處理器進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計。其裝置原理示意圖見微流控多色熒光CTC計數(shù)儀示意圖。
[0050](4)微流控多色熒光CTC檢測儀的應(yīng)用
[0051]將以上來源的結(jié)直腸癌患者10例的外周血采用微流控?zé)晒饧?xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行CTC計數(shù)統(tǒng)計和分析，結(jié)果顯示15例癌癥患者統(tǒng)計出來的循環(huán)腫瘤細(xì)胞個數(shù)分別為6、16、92、213、112、66、65、26、17、9，其結(jié)果與人工計數(shù)的結(jié)果無顯著差異，誤差范圍在±5.0%以內(nèi)，并與實際的臨床資料相符。上述的微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀分析結(jié)果與傳統(tǒng)病理人工計數(shù)結(jié)果的一致性表明，本發(fā)明的計數(shù)儀可以實現(xiàn)快速準(zhǔn)確地實現(xiàn)外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測。可以應(yīng)用于早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移、化療效果、預(yù)后的關(guān)系研究；也可以用于術(shù)后患者血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測，檢測結(jié)果與預(yù)測復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后的關(guān)系，檢測結(jié)果與用藥判定關(guān)系的初步研究；或者進(jìn)一步根據(jù)對初治和術(shù)后患者的檢測分析，初步建立早期診斷、判定復(fù)發(fā)、指導(dǎo)用藥、預(yù)測預(yù)后的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或指導(dǎo)方案。
[0052]實施例2
[0053]微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的熒光成像計數(shù)系統(tǒng)的工作流程。
[0054]腫瘤細(xì)胞熒光檢測儀關(guān)鍵組成部分，熒光成像系統(tǒng)的精確結(jié)構(gòu)見附圖1。本實施例采用萬能無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)。光線通過無限遠(yuǎn)色差校正物鏡8后成為平行光束，該平行光束經(jīng)管鏡16成像到CCD感光芯片。物鏡8與管鏡16之間可添加光學(xué)附件而不影響總放大倍數(shù)。
[0055]該熒光顯微鏡可快速區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，工作步驟如下:
[0056]1.被測細(xì)胞分別用DAP1、FITC和PE熒光試劑染色；
[0057]2.被測細(xì)胞裝載到微流控芯片3中，將微流控芯片3置于載物臺4上；
[0058]3.將二向色鏡214移出光路，濾光片轉(zhuǎn)輪15切換到空檔(不安裝濾光片)；
[0059]4.照明光源I和聚光鏡2裝置用于照明被測細(xì)胞，可觀察細(xì)胞形態(tài)。打開照明光源I，調(diào)節(jié)聚光鏡2的光圈，直到亮度適中；
[0060]5.調(diào)節(jié)顯微鏡鏡座的粗調(diào)旋鈕及細(xì)調(diào)旋鈕，直到通過攝像機(jī)17可拍攝到清晰的圖像；
[0061]此步驟可用于觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0062]6.關(guān)閉照明光源I。
[0063]7.濾光片轉(zhuǎn)輪15切換到461nm檔位；
[0064]8.二向色鏡111安裝于光路中，二向色鏡214被移出光路；
[0065]9.打開405nm激光器A 9，激光經(jīng)擴(kuò)束鏡A10、40倍物鏡8照射到被測細(xì)胞上，被DAPI熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞被激發(fā)后產(chǎn)生藍(lán)色熒光，中心波長為461nm。此時通過攝像機(jī)17可觀察到藍(lán)色熒光圖像；
[0066]此步驟用于觀察DAPI熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞產(chǎn)生的藍(lán)色熒光。
[0067]10.濾光片輪切換到525nm檔位；
[0068]11.二向色鏡111被移出光路，二向色鏡214安裝于光路中；
[0069]12.打開488nm激光器B 12，激光經(jīng)擴(kuò)束鏡B13、40倍物鏡8照射到被測細(xì)胞上，被FITC熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞被激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光，中心波長為525nm。此時通過攝像機(jī)
(17)可觀察到綠色熒光圖像；
[0070]此步驟用于觀察FITC熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞產(chǎn)生的綠色熒光。
[0071]10.濾光片轉(zhuǎn)輪15切換到670nm檔位；
[0072]11.二向色鏡111被移出光路，二向色鏡214安裝于光路中；
[0073]12.打開488nm激光器B12，激光經(jīng)擴(kuò)束鏡B13、40倍物鏡8照射到被測細(xì)胞上，被PE熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞被激發(fā)后產(chǎn)生紅色熒光，中心波長為670nm。此時通過攝像機(jī)17可觀察到紅色熒光圖像；
[0074]此步驟用于觀察PE熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞產(chǎn)生的紅色熒光。
【權(quán)利要求】
1.一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀，包括微流控芯片系統(tǒng)、熒光成像系統(tǒng)和分析計數(shù)系統(tǒng)；所述的微流控芯片系統(tǒng)包括微流控芯片(3)、計算機(jī)(19)控制的控制器(18)和管道(20);所述的熒光光源系統(tǒng)包括兩種或以上激光器，如激光器A(9)和激光器B(12)、熒光探測的物鏡(8)、和信號處理的攝像機(jī)(17);所述的分析計數(shù)系統(tǒng)包含計算機(jī)(19)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀，其特征在于，所述的微流控芯片系統(tǒng)還可選地含有載物臺(4)、電機(jī)(5)、導(dǎo)軌(6)和絲桿(7)之一或以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀，其特征在于，所述的熒光成像系統(tǒng)還可選地含有照明光源(I)、聚光鏡⑵、物鏡(8)、擴(kuò)束鏡A(1)、二向色鏡I (11)、擴(kuò)束鏡B(13)、二向色鏡2 (14)、濾光片轉(zhuǎn)輪(15)之一或以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀，其特征在于，所述的物鏡(8)優(yōu)選40倍光學(xué)物鏡，所述的激光器A (9)優(yōu)選40511111，所述的激光器8(12)優(yōu)選488nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀，其特征在于，所述的微流控芯片(3)的材質(zhì)為硅酮；具有三維結(jié)構(gòu)；芯片厚度小于50微米；芯片內(nèi)樣品容量小于10微升；芯片表面采用EpCAM抗體修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀，其特征在于，所述的熒光光源系統(tǒng)設(shè)兩種熒光激發(fā)光源；所述激光器(A)熒光激發(fā)光源激發(fā)被4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的細(xì)胞，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；所述激光器(B)熒光激發(fā)光源激發(fā)被異硫氰酸熒光素(FITC)和藻紅蛋白(PE)染色的細(xì)胞，分別產(chǎn)生綠色熒光和紅光熒光。
7.一種微流控多色熒光細(xì)胞計數(shù)儀的制備方法，包括以如下步驟制備微流控芯片⑶， 1)旋涂光刻膠于硅片表面，固化，紫外曝光后顯影，制作微流控芯片(3)模板； 2)硅酮(PDMS)按A:B為5:1混合，在真空中脫氣，倒入置有模具的培養(yǎng)皿中，倒膠厚度5毫米，80°C加熱固化60min后將PDMS與模具分離； 3)打孔，將上下兩層PDMS對準(zhǔn)，粘合；80°C烘烤I小時。
8.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀用于血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的計數(shù)和圖像分析。
9.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀用于結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)。
10.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞計數(shù)儀的應(yīng)用，包括預(yù)先進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞磁分離及鑒定；或者，包括在微流控芯片(3)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及熒光標(biāo)記狀態(tài)分析。
【文檔編號】G01N15/14GK104280329SQ201410441265
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】沈鶴柏, 袁旭軍, 隋國棟, 梁曉飛 申請人:上海柏慧康生物科技有限公司