一種血中tnni3k的濃度的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用，所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括濃度為0.1～3μg/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液、濃度為1～20μg/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液、納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液、甘油的PBS緩沖液、帶有深度和直徑分別為0.5mm和6mm的小圈的載體。該血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒可以用于對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)，最低能檢出0.08ngTNNI3K/點(diǎn)，并且耗時(shí)短，耗樣量少。
【專利說(shuō)明】—種血中TNN13K的濃度的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血中ΤΝΝΙ3Κ的濃度的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血性心臟病多由包括粥樣硬化病變引致的冠狀動(dòng)脈梗阻或狹窄所致。由于缺血性心臟病有發(fā)病突然,死亡率高的特點(diǎn),發(fā)病開始后數(shù)小時(shí)到24小時(shí)，3天到一周內(nèi)的時(shí)間里的早期診斷和對(duì)應(yīng)治療是決定其救命率高低的主要因素。一般來(lái)說(shuō)，雖然根據(jù)心電圖S-T段的缺血性抬高和CPK，心肌肌鈣蛋白I，T(cTnI, cTnT)，肌紅蛋白(MB)升高等指標(biāo)可以確診，但依然有很多的病例難以很快就下以診斷。
[0003]特別是測(cè)定血清肌紅蛋白(MB)雖可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)，但特異性差，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高；心肌肌鈣蛋白I，T(cTnI, cTnT)，有相對(duì)高的特異性，但在一些骨骼肌疾病血中同樣也會(huì)增高。cTnl不但在急性心肌梗死病人血中增高,在急性腎衰血樣標(biāo)本也有升高。
[0004]由于心肌缺血，心肌梗死導(dǎo)致的不同程度的心肌細(xì)胞壞死而泄漏到血管中導(dǎo)致血中不同程度的TNNI3K濃度增高。目前血中TNNI3K濃度的檢測(cè)主要采用酶標(biāo)法測(cè)定，但該檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)、需要較多的血樣及特殊的儀器等技術(shù)問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的之一為了解決上述的血中TNNI3K濃度的檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、需要較多的血樣及特殊的儀器等技術(shù)問(wèn)題，而提供一種檢測(cè)耗時(shí)短、需要血樣量少，不需要特殊的儀器的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供上述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三在于利用上述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，含有以下組分:
(1)、濃度為0.1?3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液
所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠IgG (H+L)抗體為 5:0.2 ?0.24 ;
(4)、甘油的PBS緩沖液
所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有的小圈的載體
所述的載體為孔徑< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纖維素膜；
所述的小圈的直徑為6mm、深度為0.5mm。
[0009]上述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體包括如下步驟:
(1)、用蒸餾水將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶解，配成濃度為0.1?3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、用蒸餾水將羊抗鼠lgG(H+L)抗體溶解，配成濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液的制備
①、納米金溶液的制備
用質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液按體積比計(jì)算，即質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液:質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液為1.5mL:1OOmL的比例進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.05?0.lmol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?8.0，即得納米金溶液；
②、在步驟①所得的納米金溶液中加入步驟(2)所得的濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗體水溶液，得到納米金-羊抗鼠IgG (H+L)抗體的混合液；
納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠IgG (H+L)抗體為 5:0.2 ?0.24 ;
(4)、甘油的PBS緩沖液的制備
將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻即得甘油的PBS緩沖液，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體的制備用打孔器在載體上壓印出小圈；
所述的載體為孔徑< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纖維素膜；
所述的小圈的直徑為6mm、深度為0.5mm。
[0010]利用上述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法，具體包括如下步驟:
(1)、將甘油的PBS緩沖液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
(2)、待步驟(I)的甘油的PBS緩沖液滲入到載體后，將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
待鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液滲入到載體后，將阻斷劑從載體的正面滴加到載體的小圈中，待阻斷劑滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次；
所述的阻斷劑為質(zhì)量百分比濃度為2-10%的牛血清白蛋白、明膠或牛奶的水溶液中的一種；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ； (3)、在兩邊有開口的塑料支撐體的上面放上吸水材料，然后再將步驟(2)洗滌后的載體的正面朝上，放在吸水材料上；
所述的吸水材料為濾紙、脫脂棉、海綿、吸水纖維中的一種或兩種以上的混合物；
(4)、用蒸餾水將待測(cè)的血樣稀釋6倍，將稀釋后的血樣從步驟(3)所得的載體I的正面緩慢滴加到載體的小圈中，待血樣滲入到載體后；
將與稀釋后的血樣等體積的納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液從載體的正面緩慢加入到載體的小圈中，待納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次，然后將為稀釋后的血樣體積5倍的銀染劑從載體的正面迅速加入到載體的小圈中，避光反應(yīng)lmin，然后用蒸餾水洗去銀染劑；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
所述的銀染劑為含有硝酸銀和對(duì)苯二酚的水溶液，其中硝酸銀的濃度為0.015mol/L和對(duì)苯二酚的濃度為0.075mol/L ；
根據(jù)小圈中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法可得出血中TNNI3K的濃度。
[0011]本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，由于采用了對(duì)鼠抗人TNNI3K單克隆抗體吸附能力強(qiáng)的載體、金標(biāo)銀染技術(shù)、用動(dòng)態(tài)吸附取代靜態(tài)吸附，從而解決了目前采用酶標(biāo)法測(cè)定血中TNNI3K濃度的檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)、需要較多的血樣及特殊的儀器等技術(shù)問(wèn)題。
[0012]利用本發(fā)明的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血液中的TNNI3K進(jìn)行檢測(cè)，其耗時(shí)較短，從固定鼠抗人TNNI3K單克隆抗體開始，到出結(jié)果僅需三分鐘；需用的血樣較少，僅需0.33 μ L ;不需要檢測(cè)的儀器；最低能檢出0.08ngTNNI3K/點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖la、帶有的小圈的載體的結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為載體，2為載體上的小圈；
圖lb、帶有的小圈的載體的A-A向的示意圖；
圖2、載體I的正面示意圖；
圖3、塑料支撐體4、吸水材料3和載體I的放置關(guān)系示意圖，自下而上依次為塑料支撐體4、吸水材料3和載體I ;
圖4、兩邊有開口的塑料支撐體的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1
一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括:
(1)、濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、濃度為Iμ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.2 ;
(4)、甘油的PBS緩沖液
所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體
所述的帶有的小圈的載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1a所示，其中I為載體，2為載體上的小圈；其A-A向的示意圖如圖1b所示；
所述的載體I為孔徑為0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜；
所述的小圈2的深度和直徑分別為0.5mm和6mm。
[0016]上述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體步驟如下:
(1)、用蒸餾水將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶解，配成濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液，步驟如下:
將Img的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體于50mL小燒杯中，加蒸餾水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL,得濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
取0.25mL的濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至25mL，得濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、用蒸餾水將羊抗鼠IgG(H+L)抗體溶解，配成濃度為Iμ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，步驟如下:
將Img的羊抗鼠IgG (H+L)抗體于50mL小燒杯中，加蒸懼水使其溶解,移至10mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL,得濃度為10 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
取2.5mL濃度為10 μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗體溶液于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至25mL，得濃度為I μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液的制備
①、納米金溶液的制備
用1.5mL的質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與10ml的質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.05mol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5，然后用蒸餾水定容至100ml，即得納米金溶液；
②、在1.3ImL步驟①所得的納米金中加入2.5mL的步驟(2)所得的濃度為I μ g/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液，然后用濃度為0.01 mol/L的磷酸氫二鈉水溶液定容至25ml，得到納米金-羊抗鼠IgG (H+L)抗體的混合液；
納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.2 ;
(4)、甘油的PBS緩沖液的制備
將甘油加入到PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻即得甘油的PBS緩沖液，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈2的載體I的制備用打孔器在載體I上壓印出小圈2 ;
其中載體I為孔徑為0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜；
所述的小圈2,其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
[0017]利用上述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)方法，具體包括如下步驟:
(1)、首先，將?ομ L甘油的PBS緩沖液從載體I的正面滴加到載體I的小圈2中，所述的載體I的正面見圖2所示；
(2)、待步驟(I)的甘油的PBS緩沖液滲入到載體I后，將2μ L濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液從步驟(I)的載體I的正面滴加到載體I的小圈2中，待濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液滲入到載體I后加入2 μ L阻斷劑，待阻斷劑滲入到載體I后，將載體I依次用洗液、蒸餾水洗滌3次；
所述的阻斷劑為質(zhì)量百分比濃度為2%的牛血清白蛋白的水溶液；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
(3)、在兩邊有開口的塑料支撐體4的上面放上吸水材料3，然后再將步驟(2)處理后的載體I的正面朝上，放在吸水材料3上，具體的放置示意圖如圖3所示，即自下而上依次為塑料支撐體4、吸水材料3和載體I ;
所述的兩邊有開口的塑料支撐體4的結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示；
所述的吸水材料3為濾紙；
(4)、然后，用蒸餾水將待測(cè)的血樣稀釋6倍，將2μL稀釋后的血樣從步驟(3)所得的載體I的正面緩慢滴加于載體I的小圈2中；
待血樣滲入到載體I后，再將2 μ L納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液從載體I的正面緩慢加到載體I的小圈2中，待納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液滲入到載體I后，將載體I依次用洗液、蒸餾水洗滌3次，然后迅速將10 μ L銀染劑從載體I的正面加入到載體I的小圈2中，避光反應(yīng)lmin，然后用100 μ L蒸餾水洗去銀染劑；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
所述的銀染劑為含有硝酸銀和對(duì)苯二酚的水溶液，其中硝酸銀的濃度為0.015mol/L和對(duì)苯二酚的濃度為0.075mol/L ；
根據(jù)載體I的小圈2中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法得出每點(diǎn)TNNI3K 的量為 0.67ngTNNI3K/ 點(diǎn)，血中 TNNI3K 的濃度 2010ng/mL。
[0018]實(shí)施例2
一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括:
(1)、濃度為3μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、濃度為20μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液
所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.24 ；
(4)、甘油的PBS緩沖液所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體
所述的載體為孔徑為0.22 μ m的多孔的硝酸纖維素膜；
所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
[0019]上述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體步驟如下:
(1)、用蒸餾水將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶解，配成濃度為3μ g/mL的鼠抗人 TNNI3K單克隆抗體水溶液，步驟如下:
將Img的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體于50mL小燒杯中，加蒸餾水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL,得濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
取7.5mL濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至25mL，得濃度為3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、用蒸餾水將羊抗鼠IgG(H+L)抗體溶解，配成濃度為20μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，步驟如下:
將Img的羊抗鼠IgG(H+L)抗體于50mL小燒杯中，加蒸懼水使其溶解,移至50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至50mL，得濃度為20 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液的制備
①、納米金溶液的制備
用1.5mL的質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與10ml的質(zhì)量百分比濃度為
0.01%氯金酸水溶液進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.lmol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，然后用蒸餾水定容至100ml，即得納米金溶液；
②、在1.31mL步驟①所得的納米金溶液中加入0.15mL的步驟(2)所得的濃度為20 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，然后用濃度為0.01 mol/L的磷酸氫二鈉水溶液定容至25ml,得到納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液；
納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.24 ；
(4)、甘油的PBS緩沖液的制備
將甘油加入到PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻即得甘油的PBS緩沖液，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體的制備用打孔器在載體上壓印出小圈；
所述的載體為孔徑為0.22 μ m的多孔的硝酸纖維素膜；
所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
[0020]利用上述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法，具體步驟如下:
(1)、首先，將?ομ L甘油的PBS緩沖液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
(2)、待步驟(I)的甘油的PBS緩沖液滲入到載體后，再將2μ L濃度為3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
待濃度為3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶液滲入到載體中后，再將2 μ L阻斷劑從載體的正面滴加到載體的小圈中，待阻斷劑滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗漆3次；
所述的阻斷劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的牛奶水溶液；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
(3)、在兩邊有開口的塑料支撐體的上面放上吸水材料，然后再將步驟(2)處理后的載體的正面朝上，放在吸水材料上；
所述的吸水材料為脫脂棉；
(4)、然后，用蒸餾水將待測(cè)的血樣稀釋6倍，將2μL稀釋后的血樣從步驟(3)所得的載體的正面緩慢滴加于載體的小圈中；
待血樣滲入到載體后，再將2 μ L納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液從載體的正面緩慢加到載體的小圈中，待納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次，然后迅速將10 μ L銀染劑從載體的正面加入到載體的小圈中，避光反應(yīng)lmin，然后用100 μ L蒸餾水洗去銀染劑；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
所述的銀染劑為含有硝酸銀和對(duì)苯二酚的水溶液，其中硝酸銀的濃度為0.015mol/L和對(duì)苯二酚的濃度為0.075mol/L ；
根據(jù)載體的小圈中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法得出每點(diǎn)TNNI3K的量為 0.08ngTNNI3K/ 點(diǎn)，血中 TNNI3K 的濃度 240ng/mL。
[0021]實(shí)施例3
一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括:
(1)、濃度為1.5 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、濃度為10μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液
所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.22 ；
(4)、甘油的PBS緩沖液
所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體
所述的載體為孔徑為0.20 μ m的多孔乙酸纖維素膜；
所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
[0022]上述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體步驟如下:
(I)、用蒸餾水將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶解，配成濃度為l.Syg/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液，步驟如下:
將Img的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體于50mL小燒杯中，加蒸餾水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL,得濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
取3.75mL濃度為10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至25mL，得濃度為1.5 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液；
(2)、用蒸餾水將羊抗鼠IgG(H+L)抗體溶解，配成濃度為10μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，步驟如下:
將Img的羊抗鼠IgG (H+L)抗體于50mL小燒杯中，加蒸懼水使其溶解,移至10mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL,得濃度為10 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液；
(3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液的制備
①、納米金溶液的制備
用1.5mL的質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與100.0mL的質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.lmol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，然后用蒸餾水定容至100ml，即得納米金溶液；
②、在2.6ImL步驟①所得的納米金溶液中加入0.55mL步驟(2)所得的濃度為10 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，然后用濃度為0.01mol/L的磷酸氫二鈉水溶液定容至25ml,即得納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液；
納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.22 ；
(4)、甘油的PBS緩沖液的制備
將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻即得甘油的PBS緩沖液，其中甘油的體積百分比濃度為30% ；
(5)、帶有的小圈的載體的制備
用打孔器在載體上壓印出小圈；
其中載體為孔徑為0.20 μ m的多孔乙酸纖維素膜；
所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
[0023]利用上述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法，具體步驟如下:
(1)、首先，將?ομ L甘油的PBS緩沖液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
(2)、待步驟(I)的甘油的PBS緩沖液滲入到載體后，再將2μ L濃度為1.5 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液從載體的正面滴加到載體的小圈中；
待濃度為1.5 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液滲入到載體后，再將2 μ L阻斷劑從載體的正面加入到載體的小圈中，待阻斷劑滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗漆3次；
所述的阻斷劑為質(zhì)量百分比濃度為5%的明膠的水溶液；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
(3)、在兩邊有開口的塑料支撐體的上面放上吸水材料，然后再將步驟(2)洗滌后的載體的正面朝上，放在吸水材料上； 所述的吸水材料為海綿；
(4)、然后，用蒸餾水將待測(cè)的血樣稀釋6倍，將2 μ L稀釋后的血樣從步驟(3)所得的載體的正面緩慢滴加于載體的小圈中；
待血樣滲入到載體后，再將2 μ L納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液從載體的正面緩慢加到載體的小圈中，待納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次，然后迅速將10 μ L銀染劑從載體的正面加入到載體的小圈中，避光反應(yīng)lmin，然后用100 μ L蒸餾水洗去銀染劑；
所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ；
所述的銀染劑為含有硝酸銀和對(duì)苯二酚的水溶液，其中硝酸銀的濃度為0.015mol/L和對(duì)苯二酚的濃度為0.075mol/L ；
根據(jù)載體的小圈中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法得出每點(diǎn)TNNI3K的量為 0.57ngTNNI3K/ 點(diǎn)，血中 TNNI3K 的濃度 1710ng/mL。
[0024]實(shí)施例4
實(shí)施例4與實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)條件相同，只是將TNNI3K的濃度為1710ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液替代血樣，做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。即用蒸餾水將TNNI3K的濃度為1710ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋6倍，用2 μ L稀釋后的ΤΝΝΙ3Κ的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0025]根據(jù)載體的小圈中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法得出每點(diǎn)ΤΝΝΙ3Κ 的量分別為 0.56,0.56,0.56ngTNNI3K/ 點(diǎn)，血中 TNNI3K 的濃度 1680、1680、1680ng/mL, TNNI3K 的回收率分別為 98.25%,98.25% 和 98.25%。
[0026]從上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法是可靠和穩(wěn)定的。
[0027]對(duì)照實(shí)施例1 (用酶標(biāo)法測(cè)定實(shí)施例3血樣中TNNI3K的濃度)
用 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.的“Protein Detector? ELISA Kit，，進(jìn)行測(cè)試，具體步驟如下:
(1)、將25mg的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體于50mL小燒杯中，加蒸餾水使其溶解，移至25mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得濃度為lmg/mL鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶液；
(2)、用移液器取88μ L濃度為lmg/mL鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液于96孔板的一孔中，加10yL固定液，放置120min，倒去未固定的溶液，用150 μ L洗液清洗，洗3遍；
(3)、加300μ L阻斷劑，放置60min，倒去多余的阻斷劑；
(4)、加2.5yL血樣，放置120min，用150 μ L洗液清洗，洗4遍;
(5)、加1001^二抗溶液，放置6011^11，用100μ L洗液清洗，洗4遍；
(6)、加100μ L酶染劑，放置30min ；
(7)、加100μL停止劑，用MTP-310Lab型酶標(biāo)儀測(cè)定出該血樣中TNNI3K的濃度為1706ng/mLo
[0028]通過(guò)上述對(duì)照實(shí)施例1與實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可以看出，利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，所得的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的酶標(biāo)法進(jìn)行相比，其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，精確度高。進(jìn)一步，可以看出利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，其耗時(shí)較短，從固定鼠抗人TNNI3K單克隆抗體開始，到出結(jié)果僅需三分鐘，而對(duì)照實(shí)施例1中傳統(tǒng)的酶標(biāo)法，從固定鼠抗人TNNI3K單克隆抗體開始，到出結(jié)果需390分鐘。并且利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，所需的血樣較少，僅需0.33 μ L,而傳統(tǒng)的酶標(biāo)法，需2.5 μ L。進(jìn)一步，可以看出利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)血樣進(jìn)行檢測(cè)，不需要特殊的檢測(cè)儀器，而傳統(tǒng)的酶標(biāo)法需用酶標(biāo)儀。
[0029] 以上所述僅是本發(fā)明的實(shí)施方式的舉例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括: (1)、濃度為0.1?3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液； (2)、濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液； (3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液 所述的納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液通過(guò)包括如下步驟的方法制備而成: ①、納米金溶液的制備 用質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液按體積比計(jì)算，即質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液:質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液為1.5mL:1OOmL的比例進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.05?0.lmol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?8.0,即得納米金溶液； ②、在步驟①所得的納米金溶液中加入步驟(2)的濃度為I?20μg/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，得到納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液； 所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠IgG (H+L)抗體為 5:0.2 ?0.24 ; (4)、甘油的PBS緩沖液 所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有直徑為6mm、深度為0.5mm的小圈的載體 所述的載體為孔徑< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纖維素膜。
2.如權(quán)利要求1所述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括: (1)、濃度為0.1 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液； (2)、濃度為Iμ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液； (3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液 所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.2 ; (4)、甘油的PBS緩沖液 所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有的小圈的載體 所述的載體為孔徑為0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜； 所述的小圈的深度和直徑分別為0.5mm和6mm。
3.如權(quán)利要求1所述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括: (1)、濃度為3μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液； (2)、濃度為20μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液； (3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液 所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠lgG(H+L)抗體為 5:0.24 ； (4)、甘油的PBS緩沖液 所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有的小圈的載體 所述的載體為孔徑為0.22 μ m的多孔的硝酸纖維素膜； 所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
4.如權(quán)利要求1所述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒，包括: (1)、濃度為1.5 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液； (2)、濃度為10μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液； (3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液 所述的納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠IgG(H+L)抗體為 5:0.22 ； (4)、甘油的PBS緩沖液 所述的甘油的PBS緩沖液，即將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻而得，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有的小圈的載體 所述的載體為孔徑為0.20 μ m的多孔乙酸纖維素膜； 所述的小圈，其深度和直徑分別為0.5mm和6_。
5.如權(quán)利要求1所述的一種血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟: (1)、用蒸餾水將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體溶解，配成濃度為0.1?3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液； (2)、用蒸餾水將羊抗鼠lgG(H+L)抗體溶解，配成濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗體水溶液； (3)、納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液的制備 ①、納米金溶液的制備 用質(zhì)量百分比濃度為I %的檸檬酸三鈉水溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液按體積比計(jì)算，即質(zhì)量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液:質(zhì)量百分比濃度為0.01%氯金酸水溶液為1.5mL:1OOmL的比例進(jìn)行混合后，攪拌反應(yīng)至所得的反應(yīng)液為酒紅色，冷至室溫，然后用濃度為0.05?0.lmol/L的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?8.0，即得納米金溶液； ②、在步驟①所得的納米金溶液中加入步驟(2)所得的濃度為I?20μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗體水溶液，得到納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液； 納米金-羊抗鼠lgG(H+L)抗體的混合液中，按質(zhì)量比計(jì)算，即納米金:羊抗鼠IgG (H+L)抗體為 5:0.2 ?0.24 ; (4)、甘油的PBS緩沖液的制備 將甘油加入到pH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中混合均勻即得甘油的PBS緩沖液，其中甘油的體積百分比濃度為30% ； (5)、帶有的小圈的載體的制備 用打孔器在載體上壓印小圈； 所述的載體為孔徑< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纖維素膜； 所述的小圈的直徑為6mm、深度為0.5mm。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒用于血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的利用血中TNNI3K的濃度的檢測(cè)試劑盒對(duì)血中TNNI3K的濃度進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于具體包括如下步驟: (1)、將甘油的PBS緩沖液從載體的正面滴加到載體的小圈中； (2)、待步驟(I)的甘油的PBS緩沖液滲入到載體后，將鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液從載體的正面滴加到載體的小圈中； 待鼠抗人TNNI3K單克隆抗體水溶液滲入到載體后，將阻斷劑從載體的正面滴加到載體的小圈中； 待阻斷劑滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次； 所述的阻斷劑為質(zhì)量百分比濃度為2-10%的牛血清白蛋白、明膠或牛奶的水溶液；所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ； (3)、在兩邊有開口的塑料支撐體的上面放上吸水材料，然后再將步驟(2)洗滌后的載體的正面朝上，放在吸水材料上； 所述的吸水材料為濾紙、脫脂棉、海綿、吸水纖維中的一種或兩種以上的混合物； (4)、用蒸餾水將待測(cè)的血樣稀釋6倍，將稀釋后的血樣從步驟(3)所得的載體的正面滴加到載體的小圈中，待血樣滲入到載體后； 將與稀釋后的血樣等體積的納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液從載體的正面加入到載體的小圈中，待納米金-羊抗鼠IgG(H+L)抗體的混合液滲入到載體后，將載體依次用洗液、蒸餾水洗滌3次，然后將為稀釋后的血樣體積5倍的銀染劑從載體的正面加入到載體的小圈中，避光反應(yīng)lmin，然后用蒸餾水洗去銀染劑； 所述的洗液為PH值為7.4磷酸氫二鈉水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，NaCl的質(zhì)量百分比濃度為10% ； 所述的銀染劑為含有硝酸銀和對(duì)苯二酚的水溶液，其中硝酸銀的濃度為0.015mol/L和對(duì)苯二酚的濃度為0.075mol/L ； 根據(jù)載體的小圈中出現(xiàn)均勻一致的灰黑色斑點(diǎn)顏色的深度，用比色法得出血中TNNI3K的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104165995SQ201410392328
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】劉小珍, 宋廣杰, 劉小舟, 賴仲方一, 陳捷 申請(qǐng)人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院
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