鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，屬于生物發(fā)酵檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括鳥苷發(fā)酵液樣品采集和制備、光譜采集、鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定、鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建和指紋圖譜的驗(yàn)證五大步驟。通過本發(fā)明構(gòu)建鳥苷發(fā)酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了利用紅外指紋圖譜方便快捷的監(jiān)控鳥苷發(fā)酵過程，建立紅外指紋圖譜監(jiān)測鳥苷發(fā)酵過程的新方法，為生物發(fā)酵過程的優(yōu)化控制開辟更為便捷的新途徑。
【專利說明】鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]指紋圖譜是法醫(yī)學(xué)上的一個概念，最早來源于19世紀(jì)末、20世紀(jì)初的犯罪學(xué)和法醫(yī)學(xué)。由于指紋具有人各不同，終生不變，觸物留痕，可以認(rèn)定人身的特點(diǎn)，指紋鑒定結(jié)論在偵察和審判中起著重要作用，被稱為“物證之首”、“證據(jù)之王”。紅外指紋圖譜鑒別技術(shù)將光譜測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)與基礎(chǔ)測試技術(shù)有機(jī)結(jié)合，參照已知產(chǎn)品的組成或性質(zhì)的信息，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)提取出樣品紅外光譜的指紋特征，確定樣品的特征指紋圖譜或進(jìn)一步建立判定模型，從而通過圖譜比較或模型識別實(shí)現(xiàn)樣品的鑒別或進(jìn)一步判斷待測樣品是否合格的一種分析方法。該技術(shù)結(jié)合了指紋圖譜概念和紅外光譜分析技術(shù)，分析范圍幾乎可覆蓋所有的有機(jī)化合物和混合物。這一技術(shù)具有樣品無損、制樣檢測快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在幾分鐘內(nèi)即可完成樣品的檢測。與常規(guī)的化學(xué)方法分析發(fā)酵液成分相比較，具有快速簡便的特點(diǎn)，可同時監(jiān)測培養(yǎng)過程中多組分濃度的變化，優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵過程的進(jìn)程。
[0003]目前，紅外指紋圖譜在中藥質(zhì)控領(lǐng)域卓見成效，它可準(zhǔn)確且又可量化地對藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價。清華大學(xué)分析中心在紅外指紋圖譜質(zhì)控中藥領(lǐng)域的成績斐然，該中心已經(jīng)先后測試了 280種對照藥材，20種偽品藥材，4種不同產(chǎn)地的藥材，400多種中藥配方顆粒等，獲得共計(jì)2000多張紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜和幾百張二維相關(guān)紅外譜。孫素琴等所著《中藥二維相關(guān)紅外光譜鑒定圖集》一書在國外也產(chǎn)生了非常大的影響，已傳入美國、英國、新加坡、馬來西亞等國。另外，紅外指紋圖譜在飼料添加劑和食品應(yīng)用也引起了越來越多的重視。中科院飼料所張萍研究員帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)出飼料添加劑產(chǎn)品紅外指紋圖譜鑒別技術(shù)。2007年，北京市食品安全監(jiān)控中心與清華大學(xué)開展紅外指紋圖譜等前沿技術(shù)在食品安全監(jiān)控中的應(yīng)用研究，將“紅外指紋”圖譜技術(shù)正式應(yīng)用到食品安全監(jiān)控中。紅外指紋圖譜在中藥、食品、飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用，開辟了相應(yīng)領(lǐng)域質(zhì)量監(jiān)控技術(shù)的新篇.1V.早。
[0004]20世紀(jì)90年代以來，紅外光譜分析技術(shù)在發(fā)酵液檢測方面的應(yīng)用得到越來越多的關(guān)注。Zeaiter等利用近紅外檢測葡萄酒發(fā)酵過程中溫度變化產(chǎn)生的影響，Georgina等利用近紅外與偏最小二乘法相結(jié)合監(jiān)測啤酒發(fā)酵過程的生物量和化學(xué)變化。彭幫柱等采用分階段處理結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法對不同發(fā)酵階段的糖度檢測。邱江等用偏最小二乘法建立了培養(yǎng)液的紅外光譜數(shù)據(jù)與常規(guī)離線化學(xué)分析結(jié)果的相關(guān)關(guān)系，成功地用于糖化酶發(fā)酵過程培養(yǎng)液中總糖、還原糖和氨氮的預(yù)測。陳雷等用聲光可調(diào)(AOTF)-近紅外(NIR)光譜技術(shù)對發(fā)酵液中發(fā)酵菌的含量進(jìn)行檢測。劉賢等采用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合偏最小二乘回歸法，研究了 142個不同種類的秸桿青貯飼料樣品的pH值和發(fā)酵產(chǎn)物(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨態(tài)氮)。張夢霖等利用近紅外光譜技術(shù)對廢水厭氧發(fā)酵處理過程進(jìn)行分析監(jiān)測，建立了厭氧發(fā)酵過程中蔗糖和揮發(fā)性脂肪酸濃度的預(yù)測模型、實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確地測定厭氧發(fā)酵過程中液相中各組分的濃度變化，為厭氧發(fā)酵過程的在線監(jiān)測提供了新的思路。國內(nèi)外紅外光譜技術(shù)在發(fā)酵過程檢測中的研究，為本課題順利開展提供思想和技術(shù)方法上的有利支撐。
[0005]鳥苷發(fā)酵過程是一個實(shí)時、非線性、多變量輸入輸出和隨機(jī)性的動態(tài)過程，發(fā)酵過程中發(fā)酵液組成復(fù)雜，組分和含量具有時變性，至今為止鳥苷發(fā)酵過程的監(jiān)測控制主要依賴操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力的化學(xué)分析檢測。如何快捷檢測鳥苷發(fā)酵過程，了解鳥苷發(fā)酵的動態(tài)，優(yōu)化控制鳥苷發(fā)酵過程，一直以來是鳥苷發(fā)酵工作者研究的主要領(lǐng)域。紅外光譜分析技術(shù)是一門發(fā)展迅猛的高新技術(shù)，不僅廣泛應(yīng)用于化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的定性定量鑒別，而且在發(fā)酵過程的檢測中日益顯示出特有的優(yōu)勢。許多發(fā)酵過程都嘗試著使用紅外光譜分析技術(shù)進(jìn)行檢測。但是，目前紅外光譜技術(shù)在發(fā)酵領(lǐng)域的使用多為發(fā)酵液中某一和幾個組分的檢測，很難真正意義上監(jiān)測控制生物發(fā)酵過程，因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】亟需解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明構(gòu)建鳥苷發(fā)酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)利用紅外指紋圖譜方便快捷的監(jiān)控鳥苷發(fā)酵過程，建立紅外指紋圖譜監(jiān)測鳥苷發(fā)酵過程的新方法，為生物發(fā)酵過程的優(yōu)化控制開辟更為便捷的新途徑。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0010]步驟(I)，發(fā)酵液樣品采集和制備:
[0011]I)菌種活化
[0012]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36_38°C恒溫靜置培養(yǎng)12_14h ；
[0013]2)種子培養(yǎng)
[0014]接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，紗布封口，置于往復(fù)式搖床上，36-37°C振蕩培養(yǎng)12-18h，得到種子液；
[0015]3)鳥苷發(fā)酵
[0016]將上述種子液以10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上或發(fā)酵罐中，36-37 °C，培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；
[0017]4)采集
[0018]將10批次的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集3份發(fā)酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發(fā)酵前期樣品、27-45h的樣品為發(fā)酵中期樣品，45-72h的樣品為發(fā)酵后期樣品；
[0019]步驟(2)，發(fā)酵液鳥苷含量的測定:
[0020]發(fā)酵液中鳥苷含量采用常用的高效液相色譜法定量測定；
[0021]步驟(3)，光譜采集:
[0022]利用紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發(fā)酵前、中、后期樣品的發(fā)酵液分別重復(fù)掃描次數(shù)5次，取平均光譜；
[0023]步驟(4)，鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0024]利用純水、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵上層清液為對照，確定發(fā)酵液紅外特征峰的位置；
[0025]步驟(5)，鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建:
[0026]以鳥苷發(fā)酵液特征峰為主要研究對象，根據(jù)步驟(2)測定的發(fā)酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發(fā)酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構(gòu)建指紋圖譜；
[0027]步驟(6)，指紋圖譜的驗(yàn)證:
[0028]10批次搖床及5批次發(fā)酵罐驗(yàn)證指紋圖譜可靠性。
[0029]本發(fā)明技術(shù)方案中步驟(I)中所述的種子培養(yǎng)時，接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中。
[0030]本發(fā)明技術(shù)方案中步驟(I)中種子培養(yǎng)時，紗布封口的紗布層數(shù)為8層。
[0031]本發(fā)明技術(shù)方案中步驟(I)中種子培養(yǎng)和鳥苷發(fā)酵時，往復(fù)式搖床的沖程76mm，速度為108r/min。
[0032]本發(fā)明技術(shù)方案中步驟(I)中鳥苷發(fā)酵時，將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中。
[0033]本發(fā)明技術(shù)方案中步驟(I)中10批次為往復(fù)式搖床和發(fā)酵罐發(fā)酵各5批。
[0034]本發(fā)明技術(shù)方案中所述的發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L，發(fā)酵條件為溫度36°C，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，ρΗ6.5，填料系數(shù)0.7，溶氧30-40%。
[0035]本發(fā)明技術(shù)方案中所述的紅外光譜儀為德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀。
[0036]本發(fā)明技術(shù)方案中所述的紅外光譜的波長范圍為4000-600CHT1。
[0037]本發(fā)明技術(shù)方案中所述的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發(fā)酵液樣品。
[0038]本發(fā)明技術(shù)方案中所述的發(fā)酵上層清液為相應(yīng)的發(fā)酵液離心后所得。
[0039]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為:本發(fā)明構(gòu)建鳥苷發(fā)酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)利用紅外指紋圖譜方便快捷的監(jiān)控鳥苷發(fā)酵過程，建立紅外指紋圖譜監(jiān)測鳥苷發(fā)酵過程的新方法，為生物發(fā)酵過程的優(yōu)化控制開辟更為便捷的新途徑；(2)本發(fā)明構(gòu)建的紅外指紋圖譜對于鳥苷產(chǎn)量測定具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是純水、發(fā)酵64h發(fā)酵液、發(fā)酵64h發(fā)酵液的上清液紅外吸收光譜；
[0041]圖2是鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收光譜圖；
[0042]圖3是發(fā)酵0_27h發(fā)酵液紅外吸收光譜比較圖；
[0043]圖4是發(fā)酵27_45h發(fā)酵液紅外吸收光譜比較圖；
[0044]圖5是發(fā)酵45_72h發(fā)酵液紅外吸收光譜比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0046]本發(fā)明實(shí)施例采用的材料、儀器、試劑和培養(yǎng)基的具體說明如下:
[0047]1.1 材料
[0048]鳥苷產(chǎn)生菌(Bacillus subtilis)(保存于河南科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室)
[0049]1.2 儀器
[0050]
TENSOR 27型紅外光譜儀德國BRUKER
生化培養(yǎng)箱(SPX-250)上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
[0051]
落地往復(fù)搖床太倉市科教器材廠
臺式高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠
電子天平上海精科天平
精密天平上海精科天平
隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
三角瓶、移液管、培養(yǎng)皿、量筒天津玻璃器械廠
SW-CJ-2FD型單人雙面超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司
HVE-50高壓滅菌鍋日本
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
電熱恒溫水溫箱北京永光明醫(yī)療儀器廠
[0052]1.3主要試劑
[0053]鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品中科院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司
[0054]1.4培養(yǎng)基
[0055](I)斜面和平板培養(yǎng)基(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))
[0056]葡萄糖0.5，酵母膏1，蛋白胨1，L-谷氨酸鈉0.5，NaCl 0.5，瓊脂2.0，余量為去離子水，pH 7.0 ;滅菌條件:121°C，20min。
[0057](2)種子培養(yǎng)基(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))
[0058]葡萄糖2，酵母膏I，蛋白胨I，玉米漿I，L-谷氨酸鈉0.25，NaCl 0.25，尿素0.2，余量為去離子水，pH 7.0。滅菌條件:118°C,20min。
[0059](3)發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))
[0060]葡萄糖12，酵母粉 1.6，L-谷氨酸鈉 1，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.4，CaCO3 2，豆餅水解液5ml/100ml，余量為去離子水，pH 7.0。滅菌條件:除CaCO3外，其余的為115°C，15min。CaCO3的滅菌條件為121°C，20min，接種前加入。
[0061]實(shí)施例1
[0062]鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0063]步驟(I)，發(fā)酵液樣品采集和制備:
[0064]I)菌種活化
[0065]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36°C恒溫靜置培養(yǎng)12h ；
[0066]2)種子培養(yǎng)
[0067]接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復(fù)式搖床上，沖程76mm，速度為108r/min，36°C振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液；
[0068]3)鳥苷發(fā)酵
[0069]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上，沖程76mm，速度為108r/min，36°C，培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；
[0070]4)采集
[0071]將10批次往復(fù)式搖床發(fā)酵的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發(fā)酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發(fā)酵前期樣品、27-45h的樣品為發(fā)酵中期樣品，45-72h的樣品為發(fā)酵后期樣品；
[0072]步驟(2)，發(fā)酵液鳥苷含量的測定:
[0073]發(fā)酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0074]步驟(3)，光譜采集:
[0075]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發(fā)酵前、中、后期樣品的發(fā)酵液及其上層清液分別重復(fù)掃描次數(shù)5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
[0076]步驟(4)，鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0077]利用純水、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵上層清液為對照，確定發(fā)酵液紅外特征峰的位置；
[0078]步驟(5)，鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建:
[0079]以鳥苷發(fā)酵液特征峰為主要研究對象，根據(jù)步驟(2)測定的發(fā)酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發(fā)酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構(gòu)建指紋圖譜；
[0080]步驟(6)，指紋圖譜的驗(yàn)證:
[0081]10批次搖床及5批次發(fā)酵罐驗(yàn)證指紋圖譜可靠性。其中，發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L，發(fā)酵條件為溫度36°C，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，pH6.5，填料系數(shù)0.7，溶氧30-40%。
[0082]實(shí)施例2
[0083]鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0084]步驟⑴，發(fā)酵液樣品采集和制備:
[0085]I)菌種活化
[0086]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，38°C恒溫靜置培養(yǎng)14h ；
[0087]2)種子培養(yǎng)
[0088]接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復(fù)式搖床上，往復(fù)式搖床的沖程76mm，速度為108r/min，37°C振蕩培養(yǎng)18h，得到種子液；
[0089]3)鳥苷發(fā)酵
[0090]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于發(fā)酵罐中，37°C，培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；
[0091]4)采集
[0092]將10批次發(fā)酵罐發(fā)酵的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發(fā)酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發(fā)酵前期樣品、27-45h的樣品為發(fā)酵中期樣品，45-72h的樣品為發(fā)酵后期樣品；
[0093]步驟(2)，發(fā)酵液鳥苷含量的測定:
[0094]發(fā)酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0095]步驟(3)，光譜采集:
[0096]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發(fā)酵前、中、后期樣品的發(fā)酵液及其上層清液分別重復(fù)掃描次數(shù)5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
[0097]步驟(4)，鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0098]利用純水、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵上層清液為對照，確定發(fā)酵液紅外特征峰的位置；
[0099]步驟(5)，鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建:
[0100]以鳥苷發(fā)酵液特征峰為主要研究對象，根據(jù)步驟(2)測定的發(fā)酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發(fā)酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構(gòu)建指紋圖譜；
[0101]步驟(6)，指紋圖譜的驗(yàn)證:
[0102]10批次搖床及5批次發(fā)酵罐驗(yàn)證指紋圖譜可靠性。
[0103]其中，發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L，發(fā)酵條件為溫度36°C，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，pH6.5，填料系數(shù)0.7，溶氧30-40
[0104]實(shí)施例3
[0105]鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0106]步驟(I)，發(fā)酵液樣品采集和制備:
[0107]I)菌種活化
[0108]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，37°C恒溫靜置培養(yǎng)13h ；
[0109]2)種子培養(yǎng)
[0110]接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復(fù)式搖床上，往復(fù)式搖床的沖程76mm，速度為108r/min，36.5°C振蕩培養(yǎng)16h，得到種子液；
[0111]3)鳥苷發(fā)酵
[0112]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上或發(fā)酵罐中，36.7°C，培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液；
[0113]4)采集
[0114]將10批次的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發(fā)酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發(fā)酵前期樣品、27-45h的樣品為發(fā)酵中期樣品，45-72h的樣品為發(fā)酵后期樣品；10批次的鳥苷發(fā)酵為往復(fù)式搖床和發(fā)酵罐發(fā)酵各5批；所述的發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L，發(fā)酵條件為溫度36 °C，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，pH6.5，填料系數(shù)0.7，溶氧30-40%;鳥苷發(fā)酵時，往復(fù)式搖床的沖程76mm,速度為108r/min ；
[0115]步驟(2)，發(fā)酵液鳥苷含量的測定:
[0116]發(fā)酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0117]步驟(3)，光譜采集:
[0118]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟⑴得到的發(fā)酵前、中、后期樣品的發(fā)酵液及其上層清液分別重復(fù)掃描次數(shù)5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-6000^1 ；
[0119]步驟(4)，鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0120]利用純水、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵上層清液為對照，確定發(fā)酵液紅外特征峰的位置；
[0121]純水、發(fā)酵64h發(fā)酵液、發(fā)酵64h發(fā)酵液的上清液紅外吸收光譜見圖1，鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收光譜見圖2。
[0122]鳥苷的結(jié)構(gòu)式為，如下所示。
[0123]
O
JL
HM
I ]L ?>
Z ^ KS-N
H3-N H
mcBz
門
HO OH
[0124]鳥苷中有0-H、C = O、C = N、C_N、N_H、C = C、C-0等基團(tuán)，這些基團(tuán)的吸收峰的位置不同。圖1中第一個峰在3300-3200(^'純水、發(fā)酵液、發(fā)酵上清液在此位置均有強(qiáng)吸收峰，且峰形較寬，符合締合O-H基團(tuán)的吸收峰；第二個峰在2300CHT1左右，圖2中鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品無此峰，比較發(fā)酵液和發(fā)酵上清液可以得出，此峰是發(fā)酵液中可以離心除去的成分的吸收所致，并不是鳥苷發(fā)酵液的特征吸收峰；第三個峰在ieOOcnf1左右，比較發(fā)現(xiàn)純水、發(fā)酵液、發(fā)酵上清液在此位置均有峰，應(yīng)屬于O-H的吸收峰。第四個峰在HOOcnf1左右，只有發(fā)酵液在此位置有吸收峰，發(fā)酵上清液在此位置沒有吸收峰，判斷也是發(fā)酵液中可以離心除去的成分的吸收所致。第五個峰在llOO-lOOOcnf1，符合C-O(醇、醚等)的吸收范圍(UOO-lOOOcnf1)，發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品在此均有吸收，C-N的吸收峰在1310-1020(^1'也在此峰附近，在鳥苷中存在較多的C-O和C-N，判斷此位置就是要研究的重點(diǎn)位置。
[0125]從圖1可以看出要研究的吸收位置峰形并不尖銳，而是比較平緩，可能是由于發(fā)酵液成分非常復(fù)雜，各種組分干擾所致，所以只能大概從峰形的變化上來研究。
[0126]步驟(5)，鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建:
[0127]以鳥苷發(fā)酵液特征峰為主要研究對象，根據(jù)步驟(2)測定的發(fā)酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發(fā)酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構(gòu)建指紋圖譜；
[0128]將發(fā)酵不同時期的發(fā)酵液進(jìn)行紅外光譜掃描，得到發(fā)酵不同時期發(fā)酵液的紅外吸收光譜，由于要研究的波數(shù)區(qū)段在llOO-lOOcnT1。
[0129]圖3為未接種培養(yǎng)基(發(fā)酵0h)，發(fā)酵9、18、27h發(fā)酵液的紅外吸收光譜比較圖。從圖中可以看出，未接種培養(yǎng)基的吸收光譜非常雜亂，峰很多，吸收強(qiáng)度很大，發(fā)酵9h的發(fā)酵液吸收光譜與之相比，除了吸收強(qiáng)度有所減小外，峰形及位置幾乎無變化。隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，發(fā)酵液的吸收峰逐漸趨向于單一化，吸收強(qiáng)度逐漸變小。
[0130]圖4為發(fā)酵27、36、45h發(fā)酵液的紅外吸收光譜比較圖。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，峰形及位置變化很小，主要是吸收強(qiáng)度的變化。
[0131]圖5為發(fā)酵45、54、63、72h發(fā)酵液的紅外吸收光譜。觀察圖發(fā)現(xiàn)，峰形及位置變化很小，吸收峰的強(qiáng)度增大得也很小。
[0132]鳥苷發(fā)酵前期主要是培養(yǎng)基中成分的變化，沒有新物質(zhì)生成或生成量很少。發(fā)酵9h的發(fā)酵液與培養(yǎng)基相比，只有吸收強(qiáng)度的減少，此時沒有鳥苷生成，吸收光譜中呈現(xiàn)的是培養(yǎng)基中某些成分的變化，吸收峰很雜亂。吸收強(qiáng)度減小的原因是培養(yǎng)基中有紅外吸收的成分的利用。18-27h培養(yǎng)基繼續(xù)被利用，鳥苷產(chǎn)生并開始累積，紅外圖譜中吸收峰變得單一，鳥苷的吸收成為主要因素。27h以后鳥苷積累的越來越多，吸收強(qiáng)度越來越大，到45h后進(jìn)入發(fā)酵的后期，鳥苷產(chǎn)率下降，產(chǎn)量變化不大，吸收峰的強(qiáng)度增大得不明顯。所以枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)鳥苷過程中鳥苷產(chǎn)量的變化情況是與發(fā)酵液紅外吸收光譜掃描的結(jié)果是相符的。
[0133]發(fā)酵液紅外吸收光譜掃描的結(jié)果與鳥苷產(chǎn)量變化是相符的。可以初步認(rèn)為用紅外吸收光譜技術(shù)檢測鳥苷的產(chǎn)量是可行的。本研究為利用紅外吸收光譜技術(shù)檢測發(fā)酵過程提供了新思路，為檢測鳥苷發(fā)酵過程提供一種方便快捷的新手段。
[0134]步驟(6)，指紋圖譜的驗(yàn)證:
[0135]10批次搖床及5批次1L發(fā)酵罐驗(yàn)證指紋圖譜可靠性，見表1。
[0136]表1鳥苷發(fā)酵液變化規(guī)律與指紋圖譜一致程度
[0137]
【權(quán)利要求】
1.鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟(I)，發(fā)酵液樣品采集和制備: 1)菌種活化 取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36-38°C恒溫靜置培養(yǎng)12-14h ； 2)種子培養(yǎng) 接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，紗布封口，置于往復(fù)式搖床上，36-37°C振蕩培養(yǎng)12-18h，得到種子液； 3)鳥苷發(fā)酵 將上述種子液以10 %的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上或發(fā)酵罐中，36-37 °C，培養(yǎng)72h，獲得發(fā)酵液； 4)米集 將10批次的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集3份發(fā)酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發(fā)酵前期樣品、27-45h的樣品為發(fā)酵中期樣品，45-72h的樣品為發(fā)酵后期樣品; 步驟(2)，發(fā)酵液鳥苷含量的測定: 發(fā)酵液中鳥苷含量采用常用的高效液相色譜法定量測定； 步驟(3)，光譜采集: 利用紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發(fā)酵前、中、后期樣品的發(fā)酵液分別重復(fù)掃描次數(shù)5次，取平均光譜； 步驟(4)，鳥苷發(fā)酵液紅外吸收特征峰位置的確定: 利用純水、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵上層清液為對照，確定發(fā)酵液紅外特征峰的位置； 步驟(5)，鳥苷發(fā)酵前、中、后期指紋圖譜的構(gòu)建: 以鳥苷發(fā)酵液特征峰為主要研究對象，根據(jù)步驟(2)測定的發(fā)酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發(fā)酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構(gòu)建指紋圖譜； 步驟￠)，指紋圖譜的驗(yàn)證: 10批次搖床及5批次發(fā)酵罐驗(yàn)證指紋圖譜可靠性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中所述的種子培養(yǎng)時，接兩環(huán)生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中種子培養(yǎng)時，紗布封口的紗布層數(shù)為8層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中種子培養(yǎng)和鳥苷發(fā)酵時，往復(fù)式搖床的沖程76mm,速度為108r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中鳥苷發(fā)酵時，將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中10批次為往復(fù)式搖床和發(fā)酵罐發(fā)酵各5批。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L，發(fā)酵條件為溫度36°C，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分，pH6.5，填料系數(shù)0.7，溶氧 30-40%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的紅外光譜儀為德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥苷發(fā)酵過程紅外指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的鳥苷發(fā)酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發(fā)酵液樣品。
【文檔編號】G01N21/3577GK104198431SQ201410456115
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】楊天佑, 張明霞, 田靜, 常景玲 申請人:河南科技學(xué)院
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