人源hsf2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人源HSF2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用，屬于生物醫(yī)學【技術領域】。本發(fā)明的技術方案包括三部分內容：1、通過蛋白質組學雙向凝膠電泳和質譜技術檢測UC病人和健康志愿者血清中的差異蛋白質。2、免疫組化法檢測不同程度UC病人結腸粘膜HSF2的表達量。3、實時定量PCR和蛋白免疫印跡技術檢測不同程度的UC病人結腸粘膜HSF2的表達量。用本發(fā)明方法比較40例UC病人和40例健康志愿者的血清，發(fā)現UC病人血清中HSF2的表達明顯升高；通過免疫組化法、實時定量PCR和蛋白免疫印跡檢測UC病人結腸粘膜中HSF2的表達，發(fā)現隨著UC疾病程度的加重，HSF2的表達逐漸增加。因此，HSF2能作為特異性診斷潰瘍性結腸炎的分子標記物被應用。
【專利說明】人源HSF2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種人源HSF2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用，屬于生物醫(yī)學【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種以反復腹痛、粘液膿血便等為特征的慢性非特異性結腸炎癥。近15年來，我國UC患病數逐年增多，至少已過20萬。該疾病現正成為我國消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因。其發(fā)病人群多為青壯年，加之其病程遷延，且與結腸癌的發(fā)病存在一定關系，嚴重影響了患者生活質量和社會生產力。有研究表明，30年以上病史的患者每年患結直腸癌的風險高達20 %，已引起臨床學者的高度重視。診斷上，主要依靠患者臨床表現、內鏡特點及病理支持。內鏡檢查及活檢作為有創(chuàng)手段，不僅患者痛苦大，而且其臨床及內鏡表現缺乏特異性，加之國內病理醫(yī)師廣泛對UC認識不足，常造成誤診；治療上，部分患者對某些藥物產生抵抗或無效，其嚴重副作用也顯著降低患者的生活質量。
[0003]UC的發(fā)病機制尚未明確，目前認為是多因素相互作用的結果，主要包括遺傳，感染，環(huán)境和免疫因素。對其病因和發(fā)病機制的認識概括為:環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌叢(或者目前尚未明確的特異性微生物)的參與下，啟動了腸道免疫和非免疫系統(tǒng)，最終導致免疫反應和炎癥過程。研究表明，熱休克因子l(Heat shock factorl, HSF1)和熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)介導炎癥性腸病的保護作用，它們通過炎癥因子基因中的熱休克元件以及影響炎癥相關的轉錄因子的途徑產生抗炎作用，但是對于熱休克因子2(Heat shock factor2, HSF2)在UC中發(fā)揮的作用國內外都尚未有任何報道。
[0004]尋找UC的特異性診斷標記物已成為國內外研究的熱點，目前仍未發(fā)現UC特異性診斷標記物。因此，尋找UC患者特異性的生物標記物作為診斷的分子標志、開發(fā)其針對性的生物制劑作為治療靶點顯得尤為重要。
【發(fā)明內容】
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[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種人源HSF2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用。
[0006]本發(fā)明的作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用的人源HSF2，其分子量為58293.18道爾頓,等電點為4.70,全序列一級結構為:
[0007]MKQSSNVPAF LSKLffTLVEE THTNEFITffS QNGQSFLVLD EQRFAKEILP KYFKHNNMASFVRQLNMYGF RKVVHIDSGI VKQERDGPVE FQHPYFKQGQ DDLLENIKRK VSSSKPEENK IRQEDLTKIISSAQKVQIKQ ETIESRLSEL KSENESLffKE VSELRAKHAQ QQQVIRKIVQ FIVTLVQNNQ LVSLKRKRPLLLNTNGAQKK NLFQHIVKEP TDNHHHKVPH SRTEGLKPRE RISDDIIIYD VTDDNADEEN IPVIPETNEDVISDPSNCSQ YPDIVIVEDD NEDEYAPVIQ SGEQNEPARE SLSSGSDGSS PLMSSAVQLN GSSSLTSEDPVTMMDSILND NINLLGKVEL LDYLDSIDCS LEDFQAMLSG RQFSIDPDLL VDSENKGLET TKNNVVQPVSEEGRKSKSKP DKQLIQYTAF PLLAFLDGNP ASSVEQASTT ASSEVLSSVD KPIEVDELLD SSLDPEPTQSKLVRLEPLTE AEASEATLFY LCELAPAPLD SDMPLLDS?
[0008]本發(fā)明的技術方案包括三部分內容:1、通過蛋白質組學雙向凝膠電泳(two-dimens ional gel electrophoresis, 2-DE)和質譜技術(Mass Speetrum, Ms)檢測 UC病人和健康志愿者血清中的差異蛋白質。2、免疫組化法檢測不同程度UC病人結腸粘膜HSF2的表達量。3、實時定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blotting)技術檢測不同程度的UC病人結腸粘膜HSF2的表達量。
[0009]本發(fā)明通過雙相凝膠電泳和質譜技術比較40例潰瘍性結腸炎(UC)病人和40例健康志愿者的血清，發(fā)現UC病人血清中HSF2的表達明顯升高；通過免疫組化法、實時定量PCR和蛋白免疫印跡技術檢測UC病人結腸粘膜中HSF2的表達，發(fā)現隨著疾病的加重(輕、中、重三級)，HSF2的表達增加；因此，HSF2能作為特異性診斷潰瘍性結腸炎的分子標記物被應用。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0010]圖1.潰瘍性結腸炎(UC)病人與健康志愿者血清中蛋白質表達的差異分析。A為陰性對照組，B為UC病人組。箭頭所示為差異表達蛋白HSF2。
[0011]圖2.免疫組化檢測HSF2在不同程度UC病人粘膜組織中的差異表達分析。A為陰性對照，B、C和D分別任對應輕、中、重度UC病人的HSF2表達水平。HSF2表達特征為胞質或胞核顯棕黃色或棕色顆粒。
[0012]圖3.實時定量PCR和蛋白免疫印跡檢測HSF2在不同程度UC病人粘膜組織中的差異表達分析。A為實時定量PCR檢測HSF2的結果，相對量以GAPDH為內參。B為蛋白免疫印跡檢測HSF2的結果，相對量以β -actin為內參。
【具體實施方式】:
[0013]實施例一:潰瘍性結腸炎(UC)病人與健康志愿者血清中蛋白質表達的差異分析。
[0014]1、血清標本收集與處理
[0015]取研究對象的空腹靜脈血5ml,室溫放置30min, 2000rpm離心20min,收集血清(不能溶血)。同組40例血清樣品，每例取30ul混合均勻。然后使用白蛋白/IgG去除試劑盒去除血清樣品中的白蛋白和IgG。再用蛋白沉淀試劑盒對樣品蛋白進行濃縮。
[0016]2、第一向固相梯度等電聚焦電泳及膠條的平衡:
[0017](I)從冰箱中取_20°C冷凍保存的水化上樣緩沖液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)一小管(lml/管)，置室溫溶解。在小管中加入0.01g DTT, 25 μ I Bio-Lyte的量加，充分混勻。從小管中取出400 μ I水化上樣緩沖液，加入100 μ I樣品，充分混勻。其中水化緩沖液與樣品的體積百分比不得小于4:1。
[0018](2)沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。
[0019](3)分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極(標有+)對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。
[0020](4)在每根膠條上覆蓋礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油3ml，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
[0021](5)對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
[0022]
【權利要求】
1.分子量為58293.18道爾頓，等電點為4.70，全序列一級結構為MKQSSNVPAFLSKLffTLVEE THTNEFITffS QNGQSFLVLD EQRFAKEILP KYFKHNNMAS FVRQLNMYGF RKVVHIDSGIVKQERDGPVE FQHPYFKQGQ DDLLENIKRK VSSSKPEENK IRQEDLTKII SSAQKVQIKQ ETIESRLSELKSENESLffKE VSELRAKHAQ QQQVIRKIVQ FIVTLVQNNQ LVSLKRKRPL LLNTNGAQKK NLFQHIVKEPTDNHHHKVPH SRTEGLKPRE RISDDIIIYD VTDDNADEEN IPVIPETNED VISDPSNCSQ YPDIVIVEDDNEDEYAPVIQ SGEQNEPARE SLSSGSDGSS PLMSSAVQLN GSSSLTSEDP VTMMDSILND NINLLGKVELLDYLDSIDCS LEDFQAMLSG RQFSIDPDLL VDSENKGLET TKNNVVQPVS EEGRKSKSKP DKQLIQYTAFPLLAFLDGNP ASSVEQASTT ASSEVLSSVD KPIEVDELLD SSLDPEPTQS KLVRLEPLTE AEASEATLFYLCELAPAPLD SDMPLLDS的人源HSF2作為潰瘍性結腸炎特異性診斷分子標記物的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK103983687SQ201410197904
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權日:2014年5月12日
【發(fā)明者】繆應雷, 王昆華, ?？±? 杜艷, 周麗峰, 楊剛 申請人:繆應雷
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