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一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于分光光度法的檢測(cè)活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，利用芽孢一旦遇到合適的環(huán)境，就會(huì)迅速萌發(fā)，從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)后芽孢折光性很強(qiáng)，而在萌發(fā)過程中，這些多層結(jié)構(gòu)吸水膨脹、折光性消失，導(dǎo)致光吸收下降。本發(fā)明以光吸收下降作為芽孢萌發(fā)活性的表征，用于評(píng)價(jià)芽孢繁殖活力的大小，可以大大簡(jiǎn)化活芽孢含量檢測(cè)流程，克服傳統(tǒng)方法檢測(cè)工作量大、周期長(zhǎng)和成本高等問題。
【專利說明】一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于分光光度法的檢測(cè)活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，屬于現(xiàn)代 微生物學(xué)技術(shù)和發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢是某些細(xì)菌在生長(zhǎng)發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成的圓形或橢圓形的抗逆性內(nèi)生休 眠體。芽孢對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗性，可耐受各種不良甚至極端 環(huán)境。
[0003] 芽孢桿菌屬是一個(gè)重要的與人類關(guān)系極為密切的微生物類群。芽孢桿菌包含許多 有特殊功能的菌株，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域研究中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，越來越引起 人們重視和研究。芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，以蠟狀芽孢桿菌為代表的諸多種類可 做飼料用微生物添加劑，提高飼料利用率，降低飼料成本，減少牲畜疾病發(fā)生；很多生物農(nóng) 藥也由芽孢桿菌制成，芽孢桿菌的許多種類是昆蟲的病原菌或者具有殺蟲活性，如蠟狀芽 孢桿菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢桿菌，尤其蘇云金芽孢桿菌及其伴胞晶體是農(nóng)業(yè)上良好的 殺蟲劑，已成為世界上產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥。另外，根據(jù)微生態(tài)學(xué)原理，對(duì)人體無害甚至有 益的芽孢桿菌還可以作為保健品或藥品服用，促進(jìn)恢復(fù)菌群平衡，防治疾病和提高人類健 康水平；很多芽孢桿菌尤其是嗜堿性芽孢桿菌在強(qiáng)堿性環(huán)境中具有出色的礦化能力，近年 來還被用于建筑材料裂縫的修復(fù)與自修復(fù)研究。
[0004] 由于芽孢具有對(duì)不良環(huán)境的抗逆性，芽孢桿菌生物制劑大都采用芽孢的形式制 備，以確保在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)具有穩(wěn)定的生物活性。而活芽孢含量是芽孢桿菌生物制劑質(zhì)量的重 要指標(biāo)。
[0005] 傳統(tǒng)的檢測(cè)活芽孢含量的方法是基于濃度梯度稀釋和平板培養(yǎng)的活菌菌落計(jì)數(shù) 法。然而，該方法需要進(jìn)行大量的稀釋、涂板、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等工作，存在工作量大、周期長(zhǎng)、效 率低和成本高等缺點(diǎn)。
[0006] 芽孢一旦遇到合適的環(huán)境，就會(huì)迅速萌發(fā)，從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。芽孢 可以被諸如肌苷、L-丙氨酸、葡萄糖、十二烷胺等物質(zhì)誘導(dǎo)萌發(fā)。芽孢的含水量低（40%)， 具有厚而致密的多層結(jié)構(gòu)，折光性很強(qiáng)，而在萌發(fā)過程中，這些多層結(jié)構(gòu)吸水膨脹、折光性 消失，導(dǎo)致光吸收下降。因此以光吸收下降作為芽孢萌發(fā)活性的表征，用于評(píng)價(jià)芽孢繁殖活 力的大小，可以大大簡(jiǎn)化活芽孢含量檢測(cè)流程，克服傳統(tǒng)方法的固有缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服檢測(cè)活芽孢含量通常所采用的常規(guī)方法存在的工作量大、周期長(zhǎng)和成本 高等問題，本發(fā)明提供了一種基于非培養(yǎng)和酶標(biāo)儀光吸收檢測(cè)的高通量檢測(cè)方法。
[0008] 高通量檢測(cè)活芽孢含量的方法如下：
[0009] 采用合適的培養(yǎng)條件培養(yǎng)待測(cè)菌種，芽孢比率達(dá)到95 %以上時(shí)，取發(fā)酵液 4000-6000 Xg離心10-20min，加入去離子水，制備高存活率的萌發(fā)芽孢水懸液，通過調(diào)整 加入去離子水的體積，調(diào)整其OD49tl值為0. 5-1. 7 ;采用傳統(tǒng)活菌菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)該芽孢懸 液的活芽孢濃度；
[0010] 選擇一種在待測(cè)菌種芽孢萌發(fā)條件下不能萌發(fā)的產(chǎn)芽孢菌種作為非萌發(fā)芽孢的 來源，采用合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，通過4000-6000 X g離心10-20min，加入去離子水，制 備兩種不同芽孢濃度的非萌發(fā)芽孢水懸液：一種的OD49tl與高存活率待測(cè)芽孢水懸液相同， 用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；另一種芽孢濃度高達(dá)IX IOici-SXIOici個(gè)/ml，用作待測(cè)樣品的光密度調(diào) 節(jié)劑。
[0011] 將上述萌發(fā)芽孢水懸液和非萌發(fā)芽孢水懸液分別以0 :1〇，1 :9,2 :8,4 :6,6 :4， 8 :2，10 :0的體積比混勻，制備萌發(fā)芽孢比率占總芽孢比率分別為0%，10%，20%，40%， 60^,80%, 100%的芽孢懸浮液，若（a)步驟中所獲得的萌發(fā)芽孢水懸液活芽孢濃度為A 個(gè)/ml，以上梯度濃度芽孢懸液的活芽孢濃度依次為則0，0· 1A，0· 2A，0· 4A，0· 6A，0· 8A， A。將以上芽孢懸浮液放入水浴鍋熱激處理，60-80°C加熱10-30分鐘。熱激處理后分別取 10-190 μ L加入多孔板中，再加入一定體積萌發(fā)緩沖液補(bǔ)足至200-300 μ L，混勻，制成萌發(fā) 反應(yīng)液，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液的初始OD值，之后將多孔板放于28-37°C恒溫培養(yǎng)箱中反 應(yīng)1. 5-3小時(shí)后，檢測(cè)終點(diǎn)OD值，計(jì)算不同芽孢懸浮液的OD下降值，以O(shè)D下降值為橫坐標(biāo)， 相應(yīng)的活的萌發(fā)芽孢濃度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。
[0012] 若待測(cè)樣品為粉劑，用去離子水在離心管或試管中將芽孢制成水懸液，通過調(diào)整 去離子水的加入量，將芽孢懸液調(diào)至OD 49tl值與步驟高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等； 若待測(cè)樣品為水懸液而且OD 49tl小于0. 5,則向該芽孢懸液中加入光密度調(diào)節(jié)劑使其OD49tl值 與高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等；若芽孢制品為水懸液而OD 49tl大于1. 7,則向該芽 孢懸液中加去離子水使其OD49tl值與步驟高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等。將盛有待 測(cè)芽孢懸浮液的離心管或試管放入水浴鍋，60-80°C加熱10-30分鐘。
[0013] 分別取與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備中芽孢懸浮液相同體積的該待測(cè)芽孢懸浮液加入多孔板 中作為實(shí)驗(yàn)組；將剩余芽孢懸液4000-6000g離心5-15min，分別取等體積上清液加入多孔 板中作為對(duì)照組；向各孔中加入一定體積芽孢萌發(fā)緩沖液，混勻。
[0014] 光密度值檢測(cè)與光密度下降值計(jì)算：利用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中芽孢萌發(fā) 反應(yīng)液的初始OD值；檢測(cè)完成后，將多孔板放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1. 5-3小時(shí)，期間 每隔30分鐘混勻1次。培養(yǎng)完成后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的 終點(diǎn)OD值。按照以下公式計(jì)算OD下降值A(chǔ)0D，將AOD值代入步驟c所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線公 式，計(jì)算獲得活芽孢含量。
[0015] Λ OD =( Λ OD1+ Λ OD2+ Λ OD3) + 3 - ( Λ ODC1+ Λ ODC2+ Λ ODC3) + 3 其中 Λ ODn 為實(shí)驗(yàn) 組第η個(gè)孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點(diǎn)初始OD的差值；Λ ODen為對(duì)照組第η個(gè) 孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點(diǎn)初始OD的差值。
[0016] 所述待測(cè)樣品可以是含有芽孢的發(fā)酵液，也可是粉狀的生物制劑。
[0017] 所述高存活率芽孢的發(fā)酵，根據(jù)待測(cè)菌種不同，需采用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
[0018] 所述非萌發(fā)芽孢菌種，根據(jù)待測(cè)菌種不同，需要從不同類群中選擇，如若待測(cè)菌株 為嗜堿性芽孢桿菌，則可選擇嗜中性PH芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢的來源；而若待測(cè)菌株為 嗜中性PH芽孢桿菌，則可選擇嗜堿性芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌的來源；若待測(cè)菌株為 嗜鹽芽孢桿菌，則可選擇不耐鹽的芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌來源。若待測(cè)菌株為不耐 鹽的芽孢桿菌，則可選擇嗜鹽芽孢桿菌作為非萌發(fā)芽孢桿菌來源；還可以將待測(cè)菌株芽孢 以121°C滅菌15min的死芽孢作為非萌發(fā)芽孢；
[0019] 所述芽孢萌發(fā)緩沖劑包括芽孢萌發(fā)劑、滲透調(diào)節(jié)劑、PH緩沖劑。
[0020] 所述芽孢萌發(fā)劑為以下化合物之一，肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷、丙氨酸、甘氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡萄糖、果糖、 肽聚糖、甘露醇、蔗糖、十二烷胺、溶菌酶、苔蘚蟲素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、大 ?蛋白腺、釀蛋白。
[0021] 所述pH緩沖劑，根據(jù)待測(cè)菌種芽孢萌發(fā)對(duì)不同pH的依賴性，選擇以下緩沖劑 中可以提供最適萌發(fā)PH的緩沖劑：磷酸鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、草酸 鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、苯二甲酸氫燕緩沖劑、甘氨酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氨-氯 化銨緩沖液、AMP (2-氨基-2甲基-1-丙醇）、AMPD (2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇）、 AMPSO (3- [ (I. 1-二甲基-2-羥乙基氨基]-2-羥基丙磺酸）、BES (N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨 基乙磺酸）、TRIS(三羥甲基氨基甲烷）、CAPS(3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸）、CAPS0(3-(環(huán)己 胺）-2-羥基-1-丙磺酸）、CHES (2-(環(huán)已胺）-3-乙磺酸）、HEPPS (4-羥乙基哌嗪丙磺酸）、 HEPPSO (3-(羥乙基哌嗪）-2-羥基丙磺酸）、HEPBS (N- (2-羥乙基）哌嗪-Ν' -4- 丁磺酸）、 MOPS (3-嗎啉丙磺酸）、、MOPSO (3- (Ν-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸）TAPS (Ν-三（羥甲基）甲 基-3-氨基丙烷磺酸）、TAPSO (3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸）。
[0022] 滲透調(diào)節(jié)劑可以為以下化合物之一，氯化鈉，氯化鉀。
[0023] 芽孢萌發(fā)劑濃度為1-lOOmM，pH緩沖劑濃度為20-2M，滲透調(diào)節(jié)劑濃度為10mM-6M。
[0024] 所述滲透調(diào)節(jié)劑濃度，根據(jù)待測(cè)菌種芽孢萌發(fā)對(duì)鹽度的依賴性，選擇10mM_3M范 圍內(nèi)合適的濃度；
[0025] 所述芽孢萌發(fā)光吸收下降的檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm-750nm。
[0026] 所述多孔板包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板任意一種。
[0027] 所述芽孢萌發(fā)緩沖劑與待測(cè)芽孢懸浮液體積比在1:9到9:1范圍內(nèi)。
[0028] 本方法實(shí)現(xiàn)了活芽孢含量的高通量檢測(cè)。以芽孢萌發(fā)引起的光吸收下降作為活芽 孢含量的表征的新方法，不依賴培養(yǎng)，不需要無菌操作，而且利用酶標(biāo)儀可以快速檢測(cè)光吸 收值。本發(fā)明新方法的效率高，速度快；反應(yīng)和檢測(cè)體系微型化，消耗試劑少，成本低；容易 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，借助自動(dòng)化高通量篩選工作站可以進(jìn)一步大幅降低工作量，提高檢測(cè)效 率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1.光吸收法檢測(cè)活芽孢含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030] 圖2.酵母粉濃度對(duì)活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0031] 圖3.淀粉濃度對(duì)活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0032] 圖4.氯化鈉濃度對(duì)活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0033] 圖5.裝液量對(duì)活芽孢產(chǎn)量的影響；
[0034] 圖6. pH對(duì)活芽孢產(chǎn)量的影響。
[0035] 在附圖中：·，實(shí)心圓為光吸收法獲得的活芽孢檢測(cè)結(jié)果；〇，空心圓為傳統(tǒng)活菌 菌落計(jì)數(shù)法獲得的活芽孢濃度檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為具體的說明，實(shí)施例中所提及的內(nèi)容并非對(duì)本 發(fā)明的限定。
[0037] 酵母粉濃度對(duì)Bacillus sp. H4活芽孢產(chǎn)量的影響，比較常規(guī)菌落計(jì)數(shù)方法和本發(fā) 明所述方法獲得的結(jié)果，以驗(yàn)證分光光度法的可行性。
[0038] 待測(cè)菌株Bacillus sp. H4為一株嗜堿芽孢桿菌，選擇嗜中性pH的菌株Bacillus subtilis ATCC6051作為非萌發(fā)芽孢的來源。將Bacillus sp.H4以8mm間距點(diǎn)接種于堿性 全酵母固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-10天。將Bacillus subtilis ATCC6051以8mm間距點(diǎn)接種 于全酵母固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-10天。用滅菌牙簽將固體培養(yǎng)基上的Bacillus subtilis ATCC6051菌落挑入滅菌去離子水中，制備成2種不同芽孢濃度的芽孢懸浮液，一種OD49tl為 1. 7的非萌發(fā)芽孢懸浮液，另一種采用YK-Heber型細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度調(diào)整濃度至 2X IOltl個(gè)/ml，作為光密度調(diào)節(jié)劑；用滅菌牙簽將固體培養(yǎng)基上的Bacillus sp. H4菌落 挑入滅菌去離子水中，制備成萌發(fā)芽孢懸浮液，使其OD49tl為1.7,采用熱激處理（60°C水浴 30min)、菌落計(jì)數(shù)法和堿性全酵母固體培養(yǎng)基檢測(cè)該芽孢懸浮液的活芽孢濃度。
[0039] 按下表將非萌發(fā)芽孢懸浮液（OD49tl為L(zhǎng) 7的Bacillus subtilisATCC6051芽孢懸 浮液）和萌發(fā)芽孢懸浮液（OD49tl為I. 7BaciIlus sp. H4芽孢懸浮液），按不同比率配制成含 有不同濃度BacilIus sp.H4芽抱，但BaciIlus subtilis ATCC6051 芽抱與BaciIlus sp.H4 芽孢的總和相同的8種芽孢懸浮液。該表中8種芽孢懸浮液進(jìn)行熱激處理，60°C水浴加熱 30min，之后每種各取25 μ L分別加入96孔板的5個(gè)孔中，再用300 μ L多通道移液器迅速 向每個(gè)孔中加入萌發(fā)緩沖劑175 μ L并混勻。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的OD49tl值，檢測(cè)完成 后將96孔板放于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)后，用300 μ L多通道移液器混勻，迅速 放于酶標(biāo)儀中檢測(cè)每個(gè)孔的OD49tl值，計(jì)算獲得OD49tl下降值，以這8種芽孢懸浮液的OD下降 值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的Bacillus sp. Η4活芽孢含量為橫坐標(biāo)，繪制如圖1所示的活芽孢含 量-OD下降值標(biāo)準(zhǔn)曲線。8種芽孢懸浮液的活芽孢含量分別為各自Bacillus Sp.H4芽孢百 分比與OD為1. 7的萌發(fā)芽孢懸浮液活芽孢含量的乘積。
[0040] 將在堿性1^培養(yǎng)液中150印111301：震蕩培養(yǎng)16小時(shí)的8&(^11118 8?.!14按8%接 種量分別接種于含有不同酵母粉濃度的MMN培養(yǎng)基（硝酸鹽無機(jī)培養(yǎng)基），如圖2所示，酵 母粉濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、6、8、1(^/1，150印111，301：發(fā)酵7-10天 ；如圖3所示，將以 上16小時(shí)種子培養(yǎng)物接種于MMN發(fā)酵液裝液量分別為25、50、75、100、125、150ml的250ml 三角瓶中，150rpm，30°C發(fā)酵7-10天；將以上16小時(shí)種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同 pH 的 MMN 發(fā)酵液，如圖 4 所示，pH 分別為 10·95、10·36、9·99、9·64、9· 16，，150rpm，30°C 發(fā) 酵7-10天；將以上16小時(shí)種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同淀粉濃度的MMN培養(yǎng)基，如 圖5所示，淀粉濃度分別為1、2、4、6、10、15、2(^/1，150印111，301：發(fā)酵7-10天 ；將以上16小 時(shí)種子培養(yǎng)物按8%接種量接種于不同氯化鈉含量的MMN培養(yǎng)基，如圖6所示，氯化鈉濃度 分別為 0、4、8、16、32、64、128g/L，150rpm，30°C發(fā)酵 7-10 天。
[0041] 采用熱處理-傳統(tǒng)活菌菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)以上不同MMN培養(yǎng)液中活芽孢含量。
[0042] 采用新發(fā)明方法檢測(cè)以上不同MMN培養(yǎng)液中活芽孢含量：發(fā)酵液采用6000Xg離 心15min，加入等體積去離子水，取I. 5ml該芽孢懸浮液加入比色皿中，用721型分光光度計(jì) 檢測(cè)OD49tl值，向OD49tl低于1. 7的發(fā)酵液中加光密度調(diào)節(jié)劑，使其OD49tl達(dá)到1. 7,向OD49tl高 于1. 7的發(fā)酵液中加去離子水，使其OD49tl減小到1. 7 (芽孢發(fā)酵收獲的芽孢懸液OD49tl -般 不會(huì)超過1. 7)。將調(diào)整好OD值的芽孢懸浮液進(jìn)行熱激處理，60°C水浴加熱30min，之后每 種各取25 μ L分別加入96孔板的5個(gè)孔中，再用300 μ L多通道移液器迅速向每個(gè)孔中加 入萌發(fā)緩沖劑175 μ L并混勻。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的OD49tl值，檢測(cè)完成后將96孔板放 于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)后，用300 μ L多通道移液器混勻，迅速放于酶標(biāo)儀中檢 測(cè)每個(gè)孔的OD49tl值，計(jì)算獲得OD49tl下降值，將OD 49tl下降值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，求出活芽孢 含量。
[0043] 兩種方法所測(cè)得不同濃度酵母粉發(fā)酵液中活芽孢含量如圖2所示；兩種方法所測(cè) 得不同裝液量條件下發(fā)酵液中活芽孢含量如圖3所示；兩種方法所測(cè)得不同pH條件下發(fā)酵 液中活芽孢含量如圖4所示；兩種方法所測(cè)得不同淀粉含量的發(fā)酵液中活芽孢含量如圖5 所示；兩種方法所測(cè)得不同濃度氯化鈉發(fā)酵液中活芽孢含量如圖6所示。由圖示可知，兩種 方法所得測(cè)試結(jié)果基本保持一致，說明本發(fā)明所述的方法有效且準(zhǔn)確。
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于分光光度法的活芽孢含量高通量檢測(cè)方法，其步驟是： a) 高存活率萌發(fā)芽孢的制備：針對(duì)待測(cè)菌種，采用合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)并制備高 存活率的萌發(fā)芽孢水懸液，調(diào)整其OD49tl值為0. 5-1. 7 ;采用傳統(tǒng)活菌菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)該芽 孢懸液的活芽孢濃度； b) 非萌發(fā)芽孢的制備：選擇一種在待測(cè)菌種芽孢萌發(fā)條件下不能萌發(fā)的產(chǎn)芽孢菌種 作為非萌發(fā)芽孢的來源，采用合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，制備兩種不同芽孢濃度的非萌發(fā) 芽孢水懸液：一種的OD 49tl與高存活率待測(cè)芽孢水懸液相同，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；另一種芽 孢濃度高達(dá)I X 101(|-5 X IOltl個(gè)/ml，用作待測(cè)樣品的光密度調(diào)節(jié)劑。 c) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將上述萌發(fā)芽孢水懸液和非萌發(fā)芽孢水懸液以不同體積比混勻， 制備含有梯度濃度萌發(fā)芽孢的芽孢懸浮液，其活的萌發(fā)芽孢濃度根據(jù)體積比與（a)步驟中 所獲得的萌發(fā)芽孢水懸液活芽孢濃度計(jì)算獲得。將以上含有梯度濃度萌發(fā)芽孢的不同芽孢 懸浮液放入水浴鍋熱激處理，60-80°C加熱10-30分鐘。熱激處理后分別取50-150 ii L加入 多孔板中，再加入一定體積萌發(fā)緩沖液，混勻，制成萌發(fā)反應(yīng)液。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液的 初始OD值，之后將多孔板放于28-37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1. 5-3小時(shí)后，檢測(cè)終點(diǎn)OD值。 計(jì)算不同濃度萌發(fā)芽孢的芽孢懸浮液的OD下降值，以O(shè)D下降值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的活的萌發(fā) 芽孢濃度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。 d) 待測(cè)樣品的預(yù)處理：若待測(cè)樣品為粉劑，用去離子水在離心管或試管中將芽孢制成 水懸液，通過調(diào)整去離子水的加入量，將芽孢懸液調(diào)至OD 49tl值與步驟（a)中高存活率萌發(fā) 芽孢水懸液OD49c!值相等；若待測(cè)樣品為水懸液而且OD 49c!小于0. 5,則向該芽孢懸液中加入 光密度調(diào)節(jié)劑使其OD49tl值與步驟（a)中高存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD 49tl值相等；若芽孢制 品為水懸液而OD49tl大于1. 7,則向該芽孢懸液中加去離子水使其OD49tl值與步驟（a)中高 存活率萌發(fā)芽孢水懸液OD49tl值相等。將盛有待測(cè)芽孢懸浮液的離心管或試管放入水浴鍋， 60-80°C加熱 10-30 分鐘。 e) 待測(cè)樣品的萌發(fā)反應(yīng)：分別取與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備中芽孢懸浮液相同體積的該待測(cè)芽 孢懸浮液加入多孔板中作為實(shí)驗(yàn)組；將剩余芽孢懸液4000-6000g離心5-15min，分別取等 體積上清液加入多孔板中作為對(duì)照組；向各孔中加入一定體積芽孢萌發(fā)緩沖液，混勻。 f) 光密度值檢測(cè)與光密度下降值計(jì)算：利用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中芽孢萌發(fā) 反應(yīng)液的初始OD值；檢測(cè)完成后，將多孔板放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1. 5-3小時(shí)，期間 每隔30分鐘混勻1次。培養(yǎng)完成后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的 終點(diǎn)OD值。按照以下公式計(jì)算OD下降值A(chǔ)0D，將AOD值代入步驟c所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線公 式，計(jì)算獲得活芽孢含量。 A OD =( A OD1+ A OD2+ A OD3) + 3 - ( A ODci+ A ODc2+ A ODc3) + 3 其中 A ODn 為實(shí)驗(yàn)組第 n個(gè)孔中芽孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點(diǎn)初始OD的差值；△ ODen為對(duì)照組第n個(gè)孔中芽 孢萌發(fā)反應(yīng)液的初始OD值與終點(diǎn)初始OD的差值。
2. 如權(quán)利要求1所述活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于采用加入芽孢光密度 調(diào)節(jié)劑的方法調(diào)節(jié)待測(cè)芽孢懸浮液樣品OD值至某一定值。
3. 如權(quán)利要求2所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于使用芽孢作為芽孢 光密度調(diào)節(jié)劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于芽孢萌發(fā)緩沖液包 括芽孢萌發(fā)劑、pH緩沖劑、滲透調(diào)節(jié)劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于芽孢萌發(fā)劑濃度為 1-lOOmM，pH緩沖劑濃度為20-100mM，滲透調(diào)節(jié)劑濃度為50-600mM。
6. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于所述芽孢萌發(fā)劑為 肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨 酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷 氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡萄糖、果糖、肽聚糖、甘露醇、蔗糖、十二烷胺、溶菌酶、苔蘚 蟲素、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白其中任意一種。
7. 如權(quán)利要求5所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于pH緩沖劑為磷酸 鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、草酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、苯二甲酸氫燕緩 沖劑、甘氨酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、氨 -氯化銨緩沖液、AMP (2-氨基-2甲基-1-丙醇）、 AMPD (2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇）、AMPSO(3-[(l. 1-二甲基-2-羥乙基氨基]-2-羥 基丙磺酸）、BES(N，N-雙（2-羥乙基）-2_氨基乙磺酸）、TRIS(三羥甲基氨基甲烷）、 CAPS (3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸）、CAPSO (3-(環(huán)己胺）-2-羥基-1-丙磺酸）、CHES (2-(環(huán)已 胺）-3-乙磺酸）、HEPPS (4-羥乙基哌嗪丙磺酸）、HEPPSO (3-(羥乙基哌嗪）-2-羥基丙磺 酸）、HEPBS (N- (2-羥乙基）哌嗪-N' -4- 丁磺酸）、M0PS (3-嗎啉丙磺酸）、、M0PS0 (3- (N-嗎 啉基）-2-羥基丙磺酸）TAPS (N-三（羥甲基）甲基-3-氨基丙烷磺酸）、TAPSO (3-三羥甲 基甲胺-2-羥基丙磺酸）其中任意一種。
8. 如權(quán)利要求4所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于滲透調(diào)節(jié)劑為氯化 鈉、氯化鉀其中任意一種。
9. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)芽孢萌發(fā)的光 吸收波長(zhǎng)為450nm-750nm。
10. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于多孔板包括6孔 板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板其中任意一種。
11. 如權(quán)利要求1所述的活芽孢含量的高通量檢測(cè)方法，其特征在于芽孢萌發(fā)緩沖劑 與待測(cè)芽孢懸浮液體積比在1:9到9:1范圍內(nèi)。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104316475SQ201410459641
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】張金龍, 鄧旭, 邢鋒, 盧靖坤, 柳秋月, 張妙君, 靳帆 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)