專利名稱:異檸檬酸測定試劑(盒)及異檸檬酸濃度測定方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒),同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度
的方法,屬于食品檢驗測定技術領域。
背景技術:
異擰檬酸isocitric acid是擰檬酸的異構(gòu)體,雖然量少,但廣泛存在于生物界。 在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多,生物能夠利用的是D 型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥 頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下變成a-酮戊二酸,在異 檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標準,GB T16771-1997,規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D_異 檸檬酸的測定方法_紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁,以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫 氫酶isocitrate dehydrogenase有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 為輔酶的酶(EC1. 1. 1.42),兩者催化同一反應。
異檸檬酸+ NAD(P)+:F^ a-酮戊二酸+ C02 + NAP(P)H + 在異檸檬酸脫氫酶催化下,樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用,生成NADH 或NADPH的含量,相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度,確定樣品中總 D-異檸檬酸的含量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法 (CoupleReaction)技術,計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處 吸光度的變化,得以測定異檸檬酸濃度的方法,同時,本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的異 檸檬酸測定試劑(盒),采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行異檸檬酸濃度測定,而且測定速度快、準確度高,因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法如下 異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶 二氧化碳+琥珀酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白酮戊二酸合成酶 2-酮戊二酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白 輔酶A+乙醛+輔酶乙醛脫氫酶乙酰_輔酶A+還原型輔酶這種方法應用異擰檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41;
EC1. 1. 1. 42)酶(偶)聯(lián)酮戊二酸合成酶(0xoglutarate synthase ;EC 1. 2. 7. 3)、乙醛脫
氫酶(acetaldehyde dehydrogenase ;EC 1.2. 1. 10)酶促反應比色終點法。異擰檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸反應產(chǎn)生二氧化碳,再通過(偶)聯(lián)合酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶的作 用,最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰),從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度,通過測量340nm處吸光度上 升的程度,可以測算異檸檬酸的濃度大小。 實驗表明,從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮,無論是單 劑、雙劑還是三劑,如下成分關系的本發(fā)明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想 無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法,其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
異檸檬酸脫氫酶
酮戊二酸合成酶
乙醛脫氫酶
琥珀酸輔酶A
還原型鐵氧還蛋
乙醛 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前,加入純凈 水,復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘,起始吸光度《0. l,測 試主波長340nm,測試副波長405nm,被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25,反應方 向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
100,1/L
500,1/L
3mmol/L
10000U/L
12000U/L
12000U/L 7mmol/L 12mmol/L 12mmol/L實施例二本實施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑,包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L琥珀酸輔酶A7mmol/L還原型鐵氧還蛋白12mmol/L乙醛12mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑50mmol/L異檸檬酸脫氫酶10000U/L酮戊二酸合成酶12000U/L乙醛脫氫酶12000U/L試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間10分鐘,起始吸光度《0.測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5,反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出異檸檬酸的濃度大小。實施例三本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑,包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L琥珀酸輔酶A7mmol/L還原型鐵氧還蛋白12mmol/L乙醛12mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L酮戊二酸合成酶12000U/L乙醛脫氫酶12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L異檸檬酸脫氫酶10000U/L試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。
測定異檸檬酸濃度時,在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間IO分鐘,起始吸光度《0. 1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑 2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左 右,檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉。 總之,實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點;試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達20mmol/L ;試劑測試的不準確 度,其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 024±0. 012 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存,活性可以穩(wěn)定一年;——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩(wěn)定期長,足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測定方法,其方法如下異檸檬酸+輔酶 異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+琥珀酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白酮戊二酸合成酶 2-酮戊二酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白輔酶A+乙醛+輔酶乙醛脫氫酶乙酰-輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度,測算出異檸檬酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測定試劑(盒),主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內(nèi)效果較好,在此范圍外,試劑仍會反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒),其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛組成多劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒),其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油2_酮戊二酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白緩沖液穩(wěn)定劑輔酶異檸檬酸脫氫酶酮戊二酸合成酶乙醛脫氫酶琥珀酸輔酶A還原型鐵氧還蛋白乙醛(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的異檸檬酸測定試劑(盒),同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法、試劑的組成及成分,屬于食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、琥珀酸輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、乙醛、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸合成酶、乙醛脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應,再將反應物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的程度,從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793764SQ200910028529
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司