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專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項目?，F(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡便、成本低的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(EnzymaticDoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+輔酶氨某酸脫氡酶含氧酸+氨+還原型輔酶
氨+過氧化氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水
谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氡酶氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶
這禾中方法應(yīng)用氨基酸脫氫酶(amino-acid dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 5 ;ECl. 4. 99. 1)酶(偶)聯(lián)谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase ;EC 1. 4. 3. 7 ;EC 1. 4. 3. 11 ;ECl. 4. 3. 15)、谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 2 ;EC 1. 4. 1. 3 ;ECl. 4. 1. 4)酶促反應(yīng)終點法。氨基酸脫氫酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。 下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
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實施例一 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 [OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
氨基酸脫氫酶 10000U/L
谷氨酸氧化酶 12000U/L
谷氨酸脫氫酶 12000U/L
過氧化氫 12mmol/L
2-酮戊二酸 16mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例二 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
過氧化氫 12mmol/L
2-酮戊二酸 16mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 氨基酸脫氫酶 10000U/L 谷氨酸氧化酶 12000U/L 谷氨酸脫氫酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例三 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
















試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
輔酶
過氧化氫
2-酮戊二酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
谷氨酸氧化酶
鹽酸緩沖液
鹽酸緩沖液
100,1/ 50mmol/L 3mmol/L 12mmol/L 16mmol/L
100,1/ 500,1/L 12000U/L 12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起
始吸光度0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達40mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達0. 03±0. 015 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的氨基酸的濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+輔酶氨基酸脫氫酶含氧酸+氨+還原型輔酶氨+過氧化氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷緩沖液穩(wěn)定劑輔酶J定試劑(盒)，主要成分包括20-1—1——500,1/L-4000mmol/L-6mmol/L谷氨酸氧化酶1--50mmol/X-50mmol/L過氧化氫2-酮戊二酸試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成。輔酶、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、2-酮戊二酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫氫酶組成。輔酶、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、2_酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、氨基酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101762495SQ200810235680
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司