一種乙?；D(zhuǎn)移酶及其抑制劑的特異性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種乙酰化轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑的特異性檢測方法。將經(jīng)乙?；D(zhuǎn)移酶乙?；暮推湟种苿┮种频臒晒饣鶊F標記的底物多肽于肽鏈端解酶中孵育催化降解，再與碳納米材料淬滅劑進行吸附，最后使用熒光分光光度計檢測。由于乙?；鶎﹄逆湺私饷附到獾淖璧K，導致納米尺度的淬滅劑分別對乙酰化前后和經(jīng)抑制劑抑制的熒光標記底物多肽的吸附淬滅作用效果不同，通過其熒光強度的變化對乙酰化轉(zhuǎn)移酶和其抑制劑進行檢測。該方法首次提出了乙?；稽c對肽鏈端解酶活性的抑制作用，并結(jié)合碳納米材料優(yōu)異的熒光淬滅性質(zhì)，具有免抗體識別、無污染、高靈敏度和終點檢測等特點；同時，檢測時間短、樣品處理簡單，應用前景好。
【專利說明】一種乙酰化轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑的特異性檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及實現(xiàn)乙?；D(zhuǎn)移酶及其抑制劑的簡便、快速、高靈敏檢測方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中起著至關(guān)重要的作用，它使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復雜，調(diào)節(jié)更為精細，功能更加完善，作用更加專一。其中乙?；D(zhuǎn)移酶催化作用下的蛋白質(zhì)乙酰化是生物體內(nèi)翻譯后修飾的重要方式之一。核小體核心組蛋白N末端尾巴上保守的賴氨酸是組蛋白乙?；奈稽c，乙?；D(zhuǎn)移酶可將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移至其賴氨酸殘基的ε-氨基上。在真核細胞中，組蛋白乙?；捌淇赡孢^程去乙酰化，對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是一個多層次、多步驟的復雜過程。因此，乙?；D(zhuǎn)移酶的簡便、快速、高靈敏檢測研究對于進一步闡明基因表達調(diào)控的機制，明確腫瘤等相關(guān)疾病發(fā)病的分子機制以及治療方法等方面有著重大的意義。傳統(tǒng)的乙?；D(zhuǎn)移酶的檢測是利用3H-或14C-標記基底乙酰輔酶A的放射性元素自顯影技術(shù)，該方法存在放射性物質(zhì)污染及操作步驟復雜等缺點。因此采用非放射性元素標記的基于抗體識別的乙?；笝z測進行了嘗試性探索研究，但突出表現(xiàn)為穩(wěn)定性較差、批次差異、交叉識別、價格高昂等缺陷，而目前基于免抗體乙?；R別機制的報道較少。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速、免抗體識別、高靈敏檢測乙?；D(zhuǎn)移酶及其抑制劑的方法。
[0004]實現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0005]a.將有熒光基團標記的乙酰化轉(zhuǎn)移酶底物多肽與乙酰輔酶A在乙?；D(zhuǎn)移酶中或在乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑中孵育催化，使乙酰輔酶A在乙?；D(zhuǎn)移酶作用下或在乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用下轉(zhuǎn)移或抑制轉(zhuǎn)移乙?；降孜锒嚯牡慕Y(jié)合位點上；
[0006]b.將a.步反應得到的反應液于肽鏈端解酶中孵育消化水解，再與碳納米材料淬滅劑進行吸附作用；
[0007]c.最后通過熒光光譜檢測，由于乙?；鶎﹄逆湺私饷附到獾牡淖璧K，熒光基團標記的修飾有乙酰基的底物多肽與碳納米材料淬滅劑有效結(jié)合，導致熒光淬滅，而經(jīng)所述的抑制劑作用的熒光基團標記的乙?；葱揎椀牡孜锒嚯慕?jīng)肽鏈端解酶降解作用，熒光仍保持；根據(jù)熒光信號的強弱實現(xiàn)對乙酰轉(zhuǎn)移酶或乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑的檢測。所述a.步中熒光基團包括一系列熒光素或可發(fā)熒光的衍生物。
[0008]所述a.步中孵育催化時間為20_100min，溫度為20_40°C。
[0009]所述b.步中與肽鏈端解酶孵育消化時間為20_60min，水解溫度為20_30°C。
[0010]所述b.步中碳納米材料淬滅劑包括氧化石墨烯、多壁碳納米管或單壁碳納米管。
[0011]所述b.步中淬滅劑吸附時間為2-30min，溫度為20-40°C。[0012]本發(fā)明的方法首次提出了乙?；稽c對肽鏈端解酶活性的抑制作用，并結(jié)合碳納米材料優(yōu)異的熒光淬滅性質(zhì)，具有免抗體識別、無污染、高靈敏度和終點檢測等特點；同時，檢測時間短、樣品處理簡單，應用前景好。
[0013]本發(fā)明按上述方案設(shè)計了一種基于乙?；嚯囊种齐逆湺私饷赶拇銣鐒?多肽納米復合熒光探針從而可高效實現(xiàn)乙酰化轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑的簡便、快速、高靈敏檢測。
[0014]乙?；揎椀降孜锒嚯牡慕Y(jié)合位點上是通過乙?；D(zhuǎn)移酶底物多肽與乙酰輔酶A在乙?；D(zhuǎn)移酶中孵育催化，使乙?；D(zhuǎn)移到底物多肽特異性賴氨酸位點的氨基上實現(xiàn)的。
[0015]目前現(xiàn)有的蛋白質(zhì)翻譯后修飾傳感分析方法多數(shù)局限于蛋白質(zhì)磷酸化上面，這主要是因為蛋白質(zhì)磷酸化易于標記和檢測，而且過程相對簡單。但由于乙?；揎椙昂蟮碾姾勺兓?、生物識別性質(zhì)以及酶作用性質(zhì)等均不易被檢測，因此開發(fā)乙?；D(zhuǎn)移酶及其抑制劑的特異性檢測方法具有非常重要的意義。而且現(xiàn)有乙酰化轉(zhuǎn)移酶的檢測多利用放射性元素自顯影技術(shù)及抗體識別的方法，存在放射性物質(zhì)污染、操作步驟復雜、穩(wěn)定性較差、交叉識別等缺陷。鑒于上述乙?；R別檢測的瓶頸，我們首次發(fā)現(xiàn)了乙酰化位點能夠有效抑制肽鏈端解酶的消化降解作用，利用這一新的識別機制結(jié)合碳納米結(jié)構(gòu)材料的熒光淬滅性質(zhì)，構(gòu)建了免抗體識別傳感器，有效實現(xiàn)了乙酰化轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑檢測。本發(fā)明檢測方法在構(gòu)建傳感界面、增強傳感響應的靈敏度及選擇性具有獨特的性能，具有簡便、快速、免抗體識別等優(yōu)異性質(zhì)。
[0016]本發(fā)明的原理如圖1所示。熒光基團標記的乙?；D(zhuǎn)移酶底物多肽能與碳納米材料淬滅劑發(fā)生有效的熒光淬滅。肽鏈端解酶能夠水解多肽成為氨基酸片段。未乙?；牡孜锒嚯模?jīng)過肽鏈端解酶的消化水解釋放出游離的熒光基團，與碳納米材料淬滅劑作用后熒光信號保持；而經(jīng)乙?；D(zhuǎn)移酶和乙酰輔酶A乙?；螅捎谝阴；鶎﹄逆湺私饷附到獾牡淖璧K，使得熒光基團標記的多肽更容易與碳納米材料淬滅劑結(jié)合而熒光淬滅。如圖2所示，乙?；昂鬅晒鈴姸炔顒e顯著，為乙酰化轉(zhuǎn)移酶作用的乙?；R別提供了可行性。
[0017]本發(fā)明通過乙?；鶎﹄逆湺私饷附到獾淖璧K，導致碳納米材料淬滅劑分別對乙酰化前后和經(jīng)抑制劑抑制的熒光基團標記底物多肽的吸附淬滅作用效果不同，通過其熒光強度的變化對乙酰化轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑進行檢測。我們構(gòu)建的這種熒光多肽/納米淬滅劑體系，首次提出了乙?；稽c有效抑制肽鏈端解酶的消化水解新原理，較好的實現(xiàn)了對乙?；D(zhuǎn)移酶和其抑制劑的簡便、快速、特異性檢測。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有零污染、較高靈敏度和免抗體識別等優(yōu)點，同時該方法操作處理簡單、檢測時間短，為蛋白乙?；芯刻峁┝擞辛κ侄巍Ｒ阴；D(zhuǎn)移酶在以氧化石墨烯為例的催化體系中最低檢測限約為InM(如圖3);此外，本發(fā)明的方法還可用來檢測乙?；种苿浒胍种苿舛菼C5tl(被抑制一半時抑制劑的濃度)值約為41.61 μ M(如圖4)。綜上所述，說明本發(fā)明方法是一種簡便、快速、免抗體識別、高靈敏檢測乙?；D(zhuǎn)移酶的新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的原理示意圖；
[0019]圖2為以氧化石墨烯為例的乙?；磻昂蟮臒晒夤庾V圖；[0020]圖3為不同濃度乙?；D(zhuǎn)移酶(自上至下:0、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100、500、IOOOnM)的熒光光譜圖；
[0021]圖4 為不同濃度抑制劑(自下至上:0,0.1,0.5,1.0,2.5,5.0,7.5、10、20、40、60、80,100,500,1000,5000 μ M)的熒光光譜圖與其熒光強度在517nm處的對數(shù)關(guān)系圖(插圖)。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0023]利用本發(fā)明方法發(fā)明人對乙?；D(zhuǎn)移酶及抑制劑的簡便、快速、高靈敏檢測。
[0024]實施例1
[0025]1、乙酰化轉(zhuǎn)移酶催化的乙?；磻?br>
[0026]將乙?；D(zhuǎn)移酶底物多肽和乙?；D(zhuǎn)移酶于乙酰輔酶A中引發(fā)體系，在20_40°C的范圍內(nèi)孵育40min。
[0027]2、肽鏈端解酶催化端解多肽-碳納米材料淬滅劑復合物熒光探針
[0028]將上述反應液與肽鏈端解酶在20-30°C的范圍內(nèi)孵育30min消化水解，之后在20-40°C的范圍內(nèi)與淬滅劑(氧化石墨烯)吸附5min。
[0029]3、熒光光譜檢測
[0030]上述反應使用熒光分光光度計檢測。根據(jù)所用熒光基團的特點，檢測條件為:激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長范圍為500_620nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。不同濃度乙?；D(zhuǎn)移酶檢測得到的熒光光譜圖可參見圖3。乙?；D(zhuǎn)移酶在此催化體系的最低檢測限約為InM。
[0031]實施例2
[0032]1、抑制劑對乙?；D(zhuǎn)移酶的抑制作用
[0033]將熒光基團修飾的底物多肽和乙?；D(zhuǎn)移酶、乙?；种苿┰?0_40°C的范圍內(nèi)作用lOmin，之后于乙酰輔酶A中引發(fā)體系，在20-40°C的范圍內(nèi)孵育40min。
[0034]2、肽鏈端解酶催化水解多肽-碳納米材料淬滅劑復合物熒光探針
[0035]將上述反應液與肽鏈端解酶在20-30°C的范圍內(nèi)孵育30min消化水解，之后在20-40°C的范圍內(nèi)與淬滅劑(氧化石墨烯)吸附5min。
[0036]3、突光光譜檢測
[0037]上述反應使用熒光分光光度計檢測。根據(jù)所用熒光基團的特點，檢測條件為:激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長范圍為500_620nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm。不同濃度抑制劑熒光光譜圖與其熒光強度在517nm處的對數(shù)關(guān)系圖(插圖)可參見圖4。乙?；种苿┰诖舜呋w系的半抑制劑濃度IC5tl值約為41.61 μ M0
【權(quán)利要求】
1.一種乙?；D(zhuǎn)移酶及其抑制劑的特異性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: a.將有熒光基團標記的乙?；D(zhuǎn)移酶底物多肽與乙酰輔酶A在乙?；D(zhuǎn)移酶中或在乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑中孵育催化，使乙酰輔酶A在乙酰化轉(zhuǎn)移酶作用下或在乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用下轉(zhuǎn)移或抑制轉(zhuǎn)移乙?；揎椀降孜锒嚯牡慕Y(jié)合位點上； b.將a.步反應得到的反應液于肽鏈端解酶中孵育消化水解，再與碳納米材料淬滅劑進行吸附作用； c.最后通過熒光光譜檢測，由于乙?；鶎﹄逆湺私饷附到獾牡淖璧K，熒光基團標記的修飾有乙酰基的底物多肽與碳納米材料淬滅劑有效結(jié)合，導致熒光淬滅，而經(jīng)所述的抑制劑作用的熒光基團標記的乙酰基未修飾的底物多肽經(jīng)肽鏈端解酶降解作用，熒光仍保持；根據(jù)熒光信號的強弱實現(xiàn)對乙酰轉(zhuǎn)移酶或乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述a.步中熒光基團包括一系列熒光素或可發(fā)熒光的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述a.步中孵育催化時間為20-100min，溫度為20-40°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述b.步中與肽鏈端解酶孵育消化時間為20-60min，水解溫度為20_30°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述b.步中碳納米材料淬滅劑包括氧化石墨烯、多壁碳納米管或單壁碳納米管。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述b.步中淬滅劑吸附時間為2-30min，溫度為20-40°C。
【文檔編號】G01N21/64GK103994989SQ201410249779
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】韓逸陶, 聶舟, 李培, 李 浩, 姚守拙 申請人:湖南大學
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