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檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒，屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)對(duì)患者血清，疾病對(duì)照血清和健康對(duì)照血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗TPO和Tg的雙特異性抗體在患者中的檢出率明顯高于對(duì)照組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明所描述的試劑盒的檢測(cè)方法提供了一種簡(jiǎn)單易行的雙特異性抗體檢測(cè)模式，可以推廣應(yīng)用于各種雙特性抗體的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒，屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人們所熟知的抗體(Antibody, Ab),是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過(guò)鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)，X射線晶體衍射呈“Y”型構(gòu)造。每個(gè)抗體分子具有兩個(gè)完全相同的由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗原結(jié)合單位(Antigen bindingfragment, Fab)0雙特異性抗體(Bispecific antibody, BsAb)則是一個(gè)薪新的抗體概念，是指含有兩個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白分子，最先的提出是指人工合成的抗腫瘤藥物，而非天然存在。1999年,荷蘭學(xué)者Schuurman等采用放免方法,在同時(shí)接受屋塵螨(House dust mite)和花粉(Grass pollen)脫敏注射治療的過(guò)敏性疾病患者的血清中，發(fā)現(xiàn)了一種可同時(shí)結(jié)合上述兩種變應(yīng)原的BsAb，提示雙特性抗體可在人體中自發(fā)產(chǎn)生，隨后的研究進(jìn)一步提示天然的雙特異性抗體可能普遍存在于長(zhǎng)期受免疫原刺激的多種疾病中。然而，究竟人類有哪些疾病可以產(chǎn)生此類抗體，這種人體內(nèi)產(chǎn)生的天然BsAb與人類疾病或某些病理生理過(guò)程具有怎樣的聯(lián)系，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，因此其相關(guān)檢測(cè)尚未納入臨床常規(guī)檢測(cè)，相關(guān)的檢測(cè)試劑盒也未上市。
[0003]橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)是一種常見自身免疫性疾病，多見于30?50歲女性，起病隱匿，發(fā)展緩慢病程較長(zhǎng)，大部分病人在開始無(wú)癥狀，最早癥狀為乏力，隨著病情的發(fā)展，可出現(xiàn)甲狀腺功能減退及粘液水腫表現(xiàn)。該病的一個(gè)典型診斷要點(diǎn)為患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在高滴度的抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(ant1-thyroidperoxidase antibodies, ant1-TPO)和抗甲狀腺球蛋白抗體(ant1-thyroglobulinantibodies, ant1-Tg),說(shuō)明該疾病患者在長(zhǎng)病程內(nèi)受到多種抗原(TP0和Tg)的同時(shí)刺激。但關(guān)于橋本甲狀腺炎患者體內(nèi)是否含有天然雙特異性抗體，并沒(méi)有過(guò)研究和報(bào)道。
[0004]目前，對(duì)于天然雙特異性抗體的研究仍不太多，檢測(cè)方法基本沿用Schuurman等建立的放射免疫測(cè)定法。這種檢測(cè)方法敏感性和特異性均較高，但是存在明顯的不足，其檢測(cè)過(guò)程使用了放射性元素，具有一定的生物危害性，且檢測(cè)需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，不利于推廣。目前放射免疫測(cè)定方法在臨床上已較為少用，而被更為簡(jiǎn)單易行、無(wú)污染、易推廣的酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)和其他檢測(cè)方法所取代。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒。
[0006]本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述試劑盒的應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:[0008]一種檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒，由以下試劑組成:
[0009](I)人甲狀腺球蛋白包被微孔板；
[0010](2)免疫標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶；
[0011](3)洗滌液:含0.05%吐溫-20的PBS溶液；
[0012](4)稀釋液:含體積百分比為20%的小牛血清的PBS ；
[0013](5)底物液:3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺；
[0014](6)陽(yáng)性對(duì)照液:含抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白雙特異性抗體的血清；
[0015](7)陰性對(duì)照液:健康人血清；
[0016](8)終止液:0.5M硫酸。
[0017]所述(I)人甲狀腺球蛋白包被微孔板的包被條件是:每個(gè)微孔加入100 μ L濃度為1-10 μ g/ml的人甲狀腺球蛋白溶液，4°C包被過(guò)夜。
[0018]所述(2)免疫標(biāo)記為酶標(biāo)記、熒光素標(biāo)記或生物素標(biāo)記。
[0019]所述酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記或堿性磷酸酶標(biāo)記。
[0020]所述(2)免疫標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶的使用濃度為100 μ L/孔。
[0021]所述(6)陽(yáng)性對(duì)照液為含抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的橋本甲狀腺炎患者血清。
[0022]所述的試劑盒在檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的雙特異性抗體中的應(yīng)用。例如用于檢測(cè)人工合成的抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的雙特異性抗體的含量，這類人工合成的雙特異性抗體可能作為診斷試劑或治療藥物用于未來(lái)的醫(yī)學(xué)研究和/或藥物開發(fā)。
[0023]所述的試劑盒在檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體中的應(yīng)用。本試劑盒可以檢測(cè)那些在患者血清中含有此類天然雙特異性抗體的疾病，尤其是當(dāng)該雙特異性抗體被證明為某疾病的檢測(cè)指標(biāo)物質(zhì)時(shí)，可極大提高檢測(cè)效率。
[0024]所述的試劑盒在檢測(cè)橋本甲狀腺炎中的應(yīng)用。本發(fā)明意想不到地發(fā)現(xiàn)，在橋本甲狀腺炎患者的血清中特異性地存在天然抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體。通過(guò)對(duì)橋本甲狀腺炎患者血清，疾病對(duì)照血清和健康對(duì)照血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗TPO和Tg的雙特異性抗體在橋本甲狀腺炎患者中的檢出率明顯高于對(duì)照組(疾病對(duì)照和健康對(duì)照)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且不同甲狀腺功能狀態(tài)的患者天然雙特異性抗體的水平也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的雙特異性抗體可以看作是存在于橋本甲狀腺炎患者血清中的一種新型指標(biāo)，且這類新型指標(biāo)與患者甲狀腺功能狀態(tài)有關(guān)。
[0025]本發(fā)明試劑盒的簡(jiǎn)要檢測(cè)程序?yàn)?
[0026](I)采用人甲狀腺球蛋白(人Tg蛋白)包被微孔板作為固相抗原；
[0027](2)加入血清樣本進(jìn)行溫育；
[0028](3)加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)；
[0029](4)加顯色底物；
[0030](5)終止讀數(shù)。
[0031]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明提供了一種雙抗原夾心法的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，使用方便，操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，安全，可用于檢測(cè)抗TPO和Tg的雙特異性抗體的及橋本甲狀腺炎。[0032]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，以使公眾更好地理解本
【發(fā)明內(nèi)容】
及應(yīng)用，并不以任何方式造成對(duì)本發(fā)明的限定。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何等同替換，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為雙特異性抗體在橋本甲狀腺炎患者、疾病對(duì)照患者和正常然血清中的分布圖，圖中HT表示丙型肝炎患者血清，DC表示疾病對(duì)照患者血清，HC表示健康人血清。
[0034]圖2為不同甲狀腺功能狀態(tài)的橋本甲狀腺炎患者中，雙特異性抗體的分布圖，圖中E表示官能正常組，sH表示亞臨床甲減組，H表示臨床甲減組。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下為實(shí)施例中涉及的主要材料和試劑:
[0036]人甲狀腺球蛋白(人Tg蛋白)，Prospec,英國(guó)
[0037]辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶(人TPO蛋白)，北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，中國(guó)
[0038]十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20),北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0039]二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20),北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0040]磷酸二氫鉀(KH2PO4),北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0041]氯化鈉(NaCl )，北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0042]氯化鉀(KCl )，北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0043]碳酸氫鈉(NaHCO3),北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0044]碳酸鈉(Na2CO3),北京化學(xué)試劑公司，中國(guó)
[0045]小牛血清，GIBC0,新西蘭
[0046]96孔酶標(biāo)板，Nunc,丹麥
[0047]吐溫-20(Tween-20)，SIGMA，美國(guó)
[0048]，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，SIGMA，美國(guó)
[0049]抗體測(cè)定溶液配制
[0050](I)磷酸鹽緩沖(PBS)溶液:NaC18g, Na2HPO4.12Η203.63g，KC10.2g，KH2PO40.24g，去離子水800mL，充分溶解后用IM HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加去離子水定容至1L，高壓滅囷后保存。
[0051](2)洗滌緩沖液PBST (洗板用):PBS1L，Tween-20500 μ L，攪拌混勻，每次使用前新鮮配制。
[0052](3)稀釋液:PBS80mL，小牛血清20mL，充分混勻，每次使用前新鮮配制。
[0053]實(shí)施例1:檢測(cè)抗TPO和Tg雙特異性抗體的試劑盒
[0054]一.試劑盒組成
[0055]1.人甲狀腺球蛋白(人Tg蛋白)包被微孔板；
[0056]2.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶(HRP標(biāo)記的人TPO蛋白):北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，中國(guó)；
[0057]3.洗滌液(PBST):含 0.05% 吐溫-20 的 PBS 溶液；(IL PBS 中加入 500 μ LTween-2O，充分混勻)
[0058]4.稀釋液:含20% (v/v)小牛血清的PBS ；
[0059]5.底物液:3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB);
[0060]6.陽(yáng)性對(duì)照液:含抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的橋本甲狀腺炎患者血清；
[0061]7.陰性對(duì)照液:健康人血清；
[0062]8.終止液:0.5M硫酸。
[0063]二.人甲狀腺球蛋白包被微孔板制備的條件及方法:
[0064]A:微孔板:Nunc,96孔板,丹麥；
[0065]B:包被緩沖液:磷酸鹽包被緩沖液(pH7.4)，NaC18g, Na2HPO4.12Η203.63g，KC10.2g，KH2PO40.24g，去離子水800mL，充分溶解后用IM HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加去離子水定容至1L，高壓滅菌后保存；
[0066]C:人Tg蛋白包被濃度:5 μ g/ml(大于I μ g/ml均可進(jìn)行包被,一般選擇1-10 μ g/ml，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整)；
[0067]D:包被條件:4°C過(guò)夜；
[0068]包被條件:每個(gè)微孔加入100 μ L濃度為5 μ g/ml的人Tg蛋白溶液，4°C包被過(guò)夜；
[0069]E:封閉:含20% (v/v)小牛血清的PBST，每孔200 μ L，37°C溫育2小時(shí)。
[0070]實(shí)施例2 -M TPO和Tg雙特異性抗體的檢測(cè)
[0071]一.材料
[0072]1.實(shí)施例1所述的試劑盒
[0073]2.血清:136份橋本甲狀腺患者血清，92疾病對(duì)照血清(包括甲亢23例、甲減20例、甲狀腺結(jié)節(jié)22例、甲狀腺腫20例、甲狀腺癌7例)，99例健康人血清。分析前均儲(chǔ)存于-80°C。
[0074]二.方法
[0075]1.雙抗原夾心法檢測(cè)抗TPO和Tg的雙特異性抗體
[0076](I)測(cè)定前，所有材料和試劑均平衡至室溫。
[0077](2)用加樣槍吸取100μ L血清加入到試劑盒提供的人Tg蛋白包被微孔板中，每個(gè)樣本均做復(fù)孔，37°C溫育I小時(shí)；
[0078](3)洗滌液(PBST)洗滌3次，拍干。
[0079](4)HRP標(biāo)記的人TPO蛋白用稀釋液進(jìn)行1:500稀釋，充分混勻后加入各微孔(100 μ L/孔)，37°C溫育I小時(shí)；
[0080](5)每孔加入100 μ L底物液，37°顯色30分鐘。
[0081](6)每孔加入50 μ L終止液終止反應(yīng)。
[0082](7)讀數(shù):用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。
[0083]2.臨界值(cut-off值)的確定
[0084]采用陰性人群測(cè)定的方法確定cut-off值，為提高檢測(cè)特異度，以正常人血清OD均值+IOSD作為陽(yáng)性判定值。
[0085]三.結(jié)果
[0086]1.雙特異性抗體測(cè)定[0087] 該測(cè)定中，以包被于微孔板上的人Tg蛋白為固相抗原，HRP標(biāo)記的人TPO蛋白為檢測(cè)抗原，檢測(cè)橋本甲狀腺炎患者血清中抗TPO和Tg的天然雙特異性抗體。疾病對(duì)照患者血清(DC)和正常人血清(HC)作為對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果見圖1和圖2。
[0088]圖1為雙特異性抗體在橋本甲狀腺炎患者血清(136例)，疾病對(duì)照患者血清(92例)和正常人血清(99例)中的分布圖。圖1結(jié)果顯示，橋本甲狀腺炎患者血清(HT組)中特異性地存在抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體，該雙特異性抗體可以作為橋本甲狀腺炎的特異性檢測(cè)指標(biāo)。
[0089]圖2為不同甲狀腺功能狀態(tài)的橋本甲狀腺炎患者中，雙特異性抗體的分布圖。圖2結(jié)果顯示，不同甲狀腺功能狀態(tài)的患者天然雙特異性抗體的水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甲狀腺功能異常患者天然雙特異性抗體檢出率較官能正常組高，雙特異性抗體的水平與橋本甲狀腺炎患者甲狀腺功能狀態(tài)相關(guān)。
[0090]2.臨界值的確定
[0091]樣本OD≥0.116判定為陽(yáng)性，否則為陰性(注:該臨界值基于本研究中99份正常人標(biāo)本數(shù)據(jù)，推廣應(yīng)用時(shí)可根據(jù)具體人群進(jìn)行調(diào)整)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成: (1)人甲狀腺球蛋白包被微孔板； (2)免疫標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶； (3)洗滌液:含0.05%吐溫-20的PBS溶液； (4)稀釋液:含體積百分比為20%的小牛血清的PBS； (5)底物液:3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺； (6)陽(yáng)性對(duì)照液:含抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白雙特異性抗體的血清； (7)陰性對(duì)照液:健康人血清； (8)終止液:0.5M硫酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述(I)人甲狀腺球蛋白包被微孔板的包被條件是:每個(gè)微孔加入100 μ L濃度為l-ΙΟμ g/ml的人甲狀腺球蛋白溶液，4°C包被過(guò)夜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述(2)免疫標(biāo)記為酶標(biāo)記、熒光素標(biāo)記或生物素標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記或堿性磷酸酶標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述(2)免疫標(biāo)記的人甲狀腺過(guò)氧化物酶的使用濃度為100 μ L/孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述(6)陽(yáng)性對(duì)照液為含抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體的橋本甲狀腺炎患者血清。
7.權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的雙特異性抗體中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶和甲狀腺球蛋白的天然雙特異性抗體中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)橋本甲狀腺炎中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK103604923SQ201310498839
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】李金明, 李文麗 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院