用于γ-分泌酶測定的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供基于Notch多肽的多肽底物、基于使用這些底物的測定方法和針對鑒定γ-分泌酶活性抑制劑的篩選方法。所述測定方法和篩選方法適用于高通量多孔板測定儀器。在許多實施方案中,底物多肽被標(biāo)記以易于檢測,和/或可結(jié)合其本身被標(biāo)記的特異性配體。一般來說,所述標(biāo)記促進檢測的高特異性以及高靈敏度。這些特征使得利用標(biāo)記底物的測定方法和篩選方法尤其適用于高通量測定方式。
【專利說明】用于Gamma-分泌酶測定的方法和組合物
[0001]本申請要求2010年9月7日提交的美國臨時申請順序號61/380,587的權(quán)益,其通過引用予以結(jié)合。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明包括但不限于用于測量伽馬-分泌酶(“ Gamma-分泌酶”)活性的組合物和方法及用于鑒定Gamma-分泌酶活性調(diào)節(jié)劑的測定法。例如,本公開內(nèi)容描述了新設(shè)計的來源于Notch細胞表面受體的底物用于Gamma-分泌酶活性的高靈敏度測定法。此外,本文鑒定的Gamma-分泌酶底物可用于鑒定Gamma-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的測定法中。
[0003]發(fā)明背景
Gamma-分泌酶加工多種底物,包括淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)和Notch蛋白。Gamma-分泌酶切割A(yù)PP釋放A β肽,這被廣泛認(rèn)為在阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)中起成因作用。
[0004]Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是存在大多數(shù)多細胞生物中的高度保守的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Artavanis-Tsakonas等,1999, Science 284 (5415): 770-776) 。Notch蛋白家族成員存在于所有后生動物中,哺乳動物具有4個不同的受體,稱為NOTCH1、N0TCH2、N0TCH3和N0TCH4。Notch受體是單-通道(single-pass)跨膜受體蛋白質(zhì)。結(jié)合Notch蛋白并啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的配體與相鄰細胞結(jié)合。Notch是由大的胞外部分組成的異寡聚體,其在鈣依賴性、非共價相互作用中與由短的胞外區(qū)、單跨膜通道和小的胞內(nèi)區(qū)組成的Notch蛋白的較小片段締合(Brou 等,2000,Mol.Cell 5 (2): 207-16)。
[0005]除了作用于APP以外,Gamma-分泌酶還加工Notch和其它I型膜蛋白。Notch還被多種蛋白酶切割。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受配體結(jié)合控制,其暴露出易遭受受體的蛋白酶剪切的負(fù)控制區(qū)。人Notchl cDNA的GenBank登記號為AF308602.1,而對于相應(yīng)的多肽基因產(chǎn)物,其為AAG33848.1。人Notchl具有2556個氨基酸殘基。在加工Notch1時,首先,近膜切割在S2部位(在殘基 Alal710 和 Vall711 之間,參見 van Tetering 等,2009,J.Biol.Chem.,284:31018-31027的補充圖SlA)通過ADAM (—種解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)金屬蛋白酶進行,除去胞外域以產(chǎn)生錨定膜的Notch胞外截短片段(NEXT)。(ADAM家族包括含有解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域和金屬蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。ADAM參與不同的細胞過程例如發(fā)育、細胞間相互作用和蛋白質(zhì)胞外域)。NEXT隨后在S3位點(參見van Tetering等,2009,J.Biol.Chem., 284:31018-31027的補充圖SlA)被Gamma-分泌酶切割,產(chǎn)生Notch胞內(nèi)域(NICD),其易位到核中,在核中其調(diào)節(jié)在胚胎發(fā)生、血細胞生成和干細胞分化期間參與決定細胞命運的靶基因的表達(Chan等,1998,Cell, 94, 423-426 ;Berezovska等,1999,Brain ResMol Brain Res., 69:273-280 和 Redmond 等,2000,Nat.Neurosc1., 3:30-40)。
[0006]Gamma-分泌酶是由至少4個亞基組成的膜結(jié)合的天冬氨酰基蛋白酶,4個亞基是早老蛋白(PS,或PS1或PS2)、Aph-1、呆蛋白(Nct)和Pen_2。PS被認(rèn)為是Gamma-分泌酶的催化亞基,并且PS1和PS2的突變已與家族性阿爾茨海默病(FAD)關(guān)聯(lián)(Sherrington等,1995, Nature, 375:754-760 ;Levy Lahad 等,1995,Science, 269:973-977)。雖然這些 FAD突變的確切病理機制未知,但是已提出假設(shè):它們改變Y -分泌酶的特異性,導(dǎo)致A β 42與Aβ 40 妝的比率提高(Borchelt 等,1996, Neuron, 17:1005-1013 ;Duff 等,1996, Nature,383:710-713 和 Bentahir 等,2006, J Neurochem.,96:732-742)。Αβ 42 比 Αβ 40 更易形成不溶性聚集體,以致FAD突變是有害的。此外,F(xiàn)AD突變還降低Y -分泌酶對Notch和E-鈣黏著蛋白加工的活性(Song等,1999,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963 ;Marambaud 等,2002,EMBO J., 21:1948-1956 和 Marambaud 等,2003,Cell,114:635-645)。若干研究表明,PSl的FAD突變影響Notch切割(Bentahir等,2006,JNeurochem., 96:732-742 ;Song等,1999,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963;Nakajima等,2000,J Neurosci Res., 62:311-317 ;Amtul 等,2002,Neurobiol Dis.,9:269-273 ;Chen 等,2002,2009,J.Biol.Chem., 277:36521-36526)。
[0007]目前尚不清楚PSl突變對Notchl切割的不同細胞作用是否歸因于細胞因素(例如Y-分泌酶復(fù)合物的成熟、底物的運輸或Y-分泌酶自身的調(diào)節(jié))。雖然已報道了使用NlOOFlag底物的無細胞的Notch/Y -分泌酶測定法(Moehlmann等,2002,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 99:8025-8030),正是基于蛋白質(zhì)印跡分析的測定法限制了其在Y -分泌酶表征中的應(yīng)用,因為它是耗費勞力的,具有低通量,而且無法定量。然而,NlOOFlag是否被 Y-分泌酶加工受到質(zhì)疑(Keller 等,2006,Biochem.,45:5351-5358)。
[0008]發(fā)明概述
需要測定PSl突變是否會直接影響Y-分泌酶的催化活性。為了監(jiān)測對于Notchl切割的Y -分泌酶活性和開發(fā)Notch特異性Y -分泌酶抑制劑,需要使用基于Notch蛋白(例如Notchl)的底物的穩(wěn)固、特異性和靈敏的體外Y-分泌酶測定法。明確需要對Y-分泌酶的輕易蛋白酶解敏感的可靠的基于Notch的底物。需要開發(fā)以高靈敏度特異性地測定Notch被Y-分泌酶蛋白酶解的產(chǎn)物的出 現(xiàn)和量的測定法。此外,仍需要開發(fā)Y-分泌酶對Notch的實時活性的測定法。此外仍需要可針對其調(diào)節(jié)PSl對Notch蛋白的活性的能力而篩選候選化合物的有效測定法。本公開內(nèi)容提供Y-分泌酶催化的Notchl切割的快速簡易的體外測定法。檢測Y-分泌酶切割的Notchl產(chǎn)物的這種新的體外Y-分泌酶測定法將是用于更好地表征Y-分泌酶和用于鑒定Y-分泌酶對Notch受體家族成員的活性的調(diào)節(jié)劑的有價值的方法。
[0009]第一方面,本公開內(nèi)容提供一種試劑,其特異性地結(jié)合在S3位點被Y -分泌酶催化的Notch受體蛋白質(zhì)切割的產(chǎn)物。在許多實施方案中,該試劑不結(jié)合未被Y-分泌酶切割的Notch受體蛋白質(zhì)。在其它實施方案中,該試劑包括抗體。在進一步的實施方案中,抗體是多克隆抗體。在其它實施方案中,抗體是單克隆抗體。在進一步的實施方案中,抗體是單鏈抗體。在進一步的實施方案中,抗體特異性地結(jié)合VLLSRKRRR (SEQ ID N0:2)。在再進一步的實施方案中,通過用包括含有序列VLLSRKRRR (SEQ ID NO:2)的肽的組合物免疫宿主動物來誘發(fā)抗體。任選序列VLLSRKRRR (SEQ ID NO: 2)還可在羧基末端包括半胱氨酸殘基。
[0010]第二方面,本公開內(nèi)容提供包括至少部分Notch蛋白的底物肽,其中底物攜帶第一標(biāo)記,且其中底物的氨基酸序列可被Y-分泌酶的活性切割以提供可檢測的包括第一標(biāo)記的產(chǎn)物肽。在某些實施方案中,底物肽包括Notch底物,例如但不限于人Notchl蛋白的氨基酸殘基1733-1812,其包括可被Y-分泌酶切割的第一易切割的肽鍵。在許多實施方案中,第一易切割的肽鍵是S3位點。在一些實施方案中,底物肽還包括與標(biāo)記的Notch氨基酸序列或其部分連接的標(biāo)簽,其中標(biāo)簽以高親和力特異性地結(jié)合靶標(biāo);在許多實施方案中,靶標(biāo)是含有麥芽糖的多糖。在再進一步的實施方案中,標(biāo)簽通過包括第二易切割的肽鍵的連接氨基酸序列與底物肽連接,其中連接氨基酸序列構(gòu)成特定蛋白酶的靶標(biāo),蛋白酶的作用導(dǎo)致標(biāo)簽從底物肽中除去。在某些實施方案中,特定蛋白酶是凝血酶。在再進一步的實施方案中,第一標(biāo)記含有標(biāo)記性氨基酸序列,其能夠起反應(yīng)以使特定結(jié)合對的第一成員與標(biāo)記性氨基酸序列連接。在另外的實施方案中,特定結(jié)合對的第一成員包括生物素。(參見圖1A和5A)。
[0011]在具體的實施方案中,底物肽以從N端到C端的順序包括特異性地結(jié)合含有麥芽糖的多糖的標(biāo)簽(例如麥芽糖結(jié)合蛋白)、凝血酶靶序列、包括相當(dāng)于Notchl蛋白的S3位點的第一易切割鍵的Notchl序列,和可起反應(yīng)以結(jié)合生物素的標(biāo)記性氨基酸序列;在某些實施方案中,標(biāo)記包括如此摻入的生物素。在再進一步的具體實施方案中,底物肽以從N端到C端的順序包括可起反應(yīng)以結(jié)合生物素的標(biāo)記性氨基酸序列、包括第一易切割鍵的Notchl序列、凝血酶靶序列和特異性地結(jié)合含有麥芽糖的多糖的標(biāo)簽。
[0012]在更進一步的方面,本公開內(nèi)容提供當(dāng)摻入合適的宿主細胞中并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下孵育時,易于表達前兩段描述的底物肽的多核苷酸。
[0013]在更進一步的方面,本公開內(nèi)容包括合成肽底物的方法,其中將前一段落描述的多核苷酸導(dǎo)入合適的宿主細胞中,將宿主細胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件孵育足以表達肽底物的一段時間,從培養(yǎng)的細胞中分離出肽底物。在又一方面,本公開內(nèi)容提供包括Y-分泌酶切割位點并在合適條件下被Y-分泌酶切割的多肽。這類多肽包括截短的Notch多肽,其具有比全長的天然Notch細胞表面受體少的氨基酸。這類多肽在本文可稱為Notch底物。
[0014]在又一方面,本公開內(nèi)容提供測定Y-分泌酶的活性的高靈敏度方法,所述方法包括以下步驟:
a)提供疑似含有Y-分泌酶活性的組合物;
b)使組合物與Y-分泌酶的多肽底物接觸,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y-分泌酶切割標(biāo)記底物提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;
c)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
1)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合所述標(biāo)記,和
2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物;和
d)測定與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和/或量。
[0015]在該方法的某些實施方案中,肽底物包括人Notchl的氨基酸殘基1733-1812。在該測定法的其它實施方案中,可檢測標(biāo)記包括生物素。在其它實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0016]在其它方面,本公開內(nèi)容提供測定Y-分泌酶活性的高通量方法,其包括以下步驟:
a)提供多個容器,每個容器裝有疑似含有Y-分泌酶活性的組合物;
b)向每個容器中加入Y-分泌酶的多肽底物,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y-分泌酶切割標(biāo)記底物為每個容器提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;
c)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
1)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合所述標(biāo)記,和
2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物;和
d)測定與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和/或量。
[0017]在該方法的不同實施方案中,每個容器是多孔測定板中的孔。在不同的其它實施方案中,板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。在該方法的某些實施方案中,肽底物包括人Notchl的氨基酸殘基1733-1812。在該測定法的其它實施方案中,可檢測標(biāo)記包括生物素。在其它實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,且第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0018]在其它方面,公開了測定細胞中的Y-分泌酶活性的方法,其包括以下步驟:
a)提供疑似含有Y-分泌酶活性的細胞;
b)加入含有Y-分泌酶的多肽底物的培養(yǎng)基,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y -分泌酶切割標(biāo)記底物提供標(biāo)記產(chǎn)物;和
c)測定標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況。
[0019]在某些實施方案中,所述測定包括
c)在適當(dāng)孵育期后分離細胞以提供上清液;和
d)測定上清液的標(biāo)記產(chǎn)物。
[0020]在某些實施方案中,測定上清液通過SDS-PAGE進行,隨后用特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的抗體進行免疫印跡法以鑒定產(chǎn)物的存在情況。在備選實施方案中,所述測定包括固定細胞,并用特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的抗體進行完整細胞中產(chǎn)物的免疫組織化學(xué)鑒定。在該方法中,培養(yǎng)基還可包括去污劑。另外,在許多實施方案中,所述標(biāo)記包括生物素。在還有的其它實施方案中,測定標(biāo)記產(chǎn)物包括測定含有產(chǎn)物和一種或多種可檢測探針的可檢測復(fù)合物,例如包括含有第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員的復(fù)合物,其中第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物。在具體的實施方案中,第一探針包括釕,使得檢測利用電化學(xué)發(fā)光法進行。在該測定法的其它實施方案中,還包括
c)在適當(dāng)孵育期后分離細胞以提供上清液;
d)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
I)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合所述標(biāo)記,和2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物;和
e)測定與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和/或量。
[0021 ] 在后一實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在還更進一步的備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0022]在其它方面,本公開內(nèi)容提供篩選Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的方法,其包括以下步驟:
a)提供裝有包括Y-分泌酶活性的組合物的容器;
b)使組合物與包括候選化合物和Y-分泌酶的多肽底物的混合物接觸,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y-分泌酶切割標(biāo)記底物提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和
c)測定候選化合物是否調(diào)節(jié)Y-分泌酶催化切割底物以形成標(biāo)記產(chǎn)物。
[0023]在該方法的某些實施方案中,肽底物包括人Notchl的氨基酸殘基1733-1812。在該方法的許多實施方案中,所述標(biāo)記包括生物素。在其它實施方案中,測定標(biāo)記產(chǎn)物的形成包括測定包括產(chǎn)物和一種或多種可檢測探針的可檢測復(fù)合物。在某些實施方案中,復(fù)合物含有包括第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員,其中第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物,而在某些實施方案中`,第一探針包括釕,使得檢測利用電化學(xué)發(fā)光法進行。
[0024]在該方法的其它實施方案中,所述測定還包括
d)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
1)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合標(biāo)記,和
2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合產(chǎn)物;和
e)測定與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和/或量。
[0025]在這種變化的某些實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0026]在其它方面,本公開內(nèi)容提供篩選Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的高通量方法,其包括以下步驟:
a)提供多個容器,每個容器裝有含有Y-分泌酶活性的組合物;
b)向每個容器中加入包括候選化合物和Y-分泌酶的多肽底物的組合物,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y-分泌酶切割標(biāo)記底物提供以聞靈敏度可檢測的標(biāo)記廣物;和
C)測定候選化合物是否調(diào)節(jié)Y-分泌酶催化切割底物以形成標(biāo)記產(chǎn)物。
[0027]在該篩選方法的不同實施方案中,每個容器是多孔測定板中的孔;而在篩選的具體實施方案中,板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。
[0028]在該方法的某些實施方案中,肽底物包括人Notchl的氨基酸殘基1733-1812。在該方法的許多實施方案中,所述標(biāo)記包括生物素。在其它實施方案中,測定標(biāo)記產(chǎn)物的形成包括測定包括產(chǎn)物和一種或多種可檢測探針的可檢測復(fù)合物。在某些實施方案中,復(fù)合物含有包括第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員,其中第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物,而在某些實施方案中,第一探針包括釕,使得檢測利用電化學(xué)發(fā)光法進行。
[0029]在高通量篩選方法的其它實施方案中,所述測定還包括
c)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
1)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合所述標(biāo)記,和
2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物;和
d)測定候選化合物是否調(diào)節(jié)與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和
/或量° [0030]在這種變化的某些實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0031]在還更進一步的方面,本公開內(nèi)容提供的是篩選細胞的Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的方法,其包括以下步驟:
a)提供裝有含有Y-分泌酶活性的細胞的容器;
b)向容器中加入含有候選化合物和Y-分泌酶的多肽底物的培養(yǎng)基,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y -分泌酶切割標(biāo)記底物提供以聞靈敏度可檢測的標(biāo)記廣物;和
c)測定候選化合物是否調(diào)節(jié)標(biāo)記產(chǎn)物的形成。
[0032]在某些實施方案中,所述測定包括
c)在適當(dāng)孵育期后分離細胞以提供上清液;和
d)測定上清液以測定候選化合物是否調(diào)節(jié)標(biāo)記產(chǎn)物的形成。
[0033]在某些實施方案中,測定上清液通過SDS-PAGE進行,隨后用特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的抗體進行免疫印跡法以鑒定產(chǎn)物的存在情況。在備選實施方案中,測定包括固定細胞,并用特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的抗體進行完整細胞中產(chǎn)物的免疫組織化學(xué)鑒定。在該方法中,培養(yǎng)基還可包括去污劑。在該方法的某些實施方案中,肽底物包括人Notchl的氨基酸殘基1733-1812。另外,在許多實施方案中,所述標(biāo)記包括生物素。在還有的其它實施方案中,測定標(biāo)記產(chǎn)物包括測定含有產(chǎn)物和一種或多種可檢測探針的可檢測復(fù)合物,例如包括含有第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員的復(fù)合物,其中第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物。在具體的實施方案中,第一探針包括釕,使得檢測利用電化學(xué)發(fā)光法進行。在該測定法的其它實施方案中,還包括
c)在適當(dāng)孵育期后分離細胞以提供上清液;
d)使標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸
1)帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中第一配體特異性地結(jié)合所述標(biāo)記,和
2)帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中第二配體特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物;和
e)測定候選化合物是否調(diào)節(jié)與第一配體和與第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和
/或量°
[0034]在后一實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白,第一標(biāo)簽含有可檢測的第一熒光團,而在進一步的實施方案中,第二配體包括這樣的第一抗體,其:a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端,和b)與帶有第二熒光團的第二抗體結(jié)合,使得在第一熒光團和第二熒光團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在還更進一步的備選實施方案中,第一配體包括抗生物素蛋白和將三線態(tài)氧轉(zhuǎn)化成單線態(tài)氧的光敏劑,第二配體包括a)特異性地結(jié)合產(chǎn)物的新產(chǎn)生的鏈末端的第一抗體,b)結(jié)合第一抗體的第二抗體,和c)由單線態(tài)氧依賴性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光發(fā)射體。
[0035]在還有的其它方面,本公開內(nèi)容提供篩選細胞的Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的高通量方法,所述方法包括以下步驟:
a)提供多個容器,每個容器裝有含有Y-分泌酶活性的細胞;` b)向每個容器中加入包括候選化合物和Y-分泌酶的多肽底物的培養(yǎng)基,所述多肽底物包括與可檢測標(biāo)記結(jié)合的至少一部分Notch蛋白,其中通過Y -分泌酶切割標(biāo)記底物提供以聞靈敏度可檢測的標(biāo)記廣物;和
c)在每個容器中測定候選化合物是否調(diào)節(jié)Y-分泌酶催化切割底物以形成標(biāo)記產(chǎn)物。
[0036]在該篩選方法的不同實施方案中,每個容器是多孔測定板中的孔;在某些實施方案中板含有至少96孔或至少384孔或至少1536孔。
[0037]附圖簡述
圖1.使用質(zhì)粒pIAD16-MBP-Nl-Avi產(chǎn)生生物素化重組Nl-Sbl底物。A)蛋白質(zhì)表達和純化的圖示。B)產(chǎn)物的考馬斯染色。C)純化產(chǎn)物的LC-MS分析。
[0038]圖2.具有Nl-Sbl插入序列的pIAD16的質(zhì)粒圖。
[0039]圖3.MBP-Nl-Sbl融合物的核苷酸序列(SEQ ID NO:4) ?
[0040]圖4.具有Nl-Sbl插入序列的pIAD16的質(zhì)粒序列(SEQ ID NO:5)。
[0041]圖5.體外Nl-Sbl Y _分泌酶測定法。A.體外Y _分泌酶測定法和采用擴增發(fā)光近距離均相測定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)檢測的圖示。B.L685458和化合物E對Y -分泌酶活性的抑制效能。C.使用Nl-Sbl底物的Y -分泌酶的動力學(xué)分析。
[0042]圖6.蛋白質(zhì)印跡分析中SM320抗體特異性地識別Y -分泌酶切割的Notch產(chǎn)物(A)和免疫染色(B)。在Y-分泌酶抑制劑(L-685, 458)不存在或存在下,將Δ E-Notchl(胞外部分缺失的Notch構(gòu)建體)或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中。用抗MYC和SM320抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞裂解物㈧。將ΛE-Notchl轉(zhuǎn)染的細胞固定、透化并用DAPI (可見深藍色形狀)、抗Myc/抗小鼠-Alexa-fluor 594 (紅色)和SM321/抗兔-Alexa-fluor488 (綠色)染色。B.4區(qū).在L-685458不存在時的合并圖像(1-3區(qū))。在深藍色形狀的背景下,在中部觀察到淺黃色至黃橙色斑點。5區(qū).在L-685458存在時的SM320染色。未觀察到任何顏色的斑點。6區(qū).L-685,458處理細胞的合并圖像。(未檢測到綠色。在模糊的深藍色形狀的背景下,可見到散布有黑色的深紅色斑塊)。
[0043]圖7.各種PSl物類的Y-分泌酶活性。A) Nl-Sbl底物。B) Sb4底物。C) Nl-Sbl底物。D) Sb4底物。
[0044]圖8.各種PSl物類的Y -分泌酶活性。A)隨底物濃度而變化的各種PSl物類的信號強度。B)隨底物濃度而變化的膜級分中的各種PSl物類的信號強度。C) Y-分泌酶被化合物E抑制。D) Y -分泌酶活性被L-685,458抑制。
[0045]圖9.ALPHA測定法中所觀察到的Y -分泌酶活性對不同實驗參數(shù)的依賴。A)對SM320抗體濃度的依賴。B)對鏈霉抗生物素供體珠濃度的依賴。C)對A蛋白接納珠濃度的依賴。D)應(yīng)用于384和1536孔板的優(yōu)化條件。
[0046]圖10.PSl突變改變Y-分泌酶的S2亞口袋(subpocket)構(gòu)象。(a) L458側(cè)鏈殘基(P/P’位置)與相應(yīng)的Y-分泌酶亞位點(S/S’)間的相互作用的圖示。(b) JC8、GY4和L646的結(jié)構(gòu),其中二苯甲酮分別摻入L458的P1’、P1或P2部位。使生物素與探針連接以利于光標(biāo)記蛋白(photolabeled protein)的分離。(c)具有JC8、GY4和L646的PSl NTF的光標(biāo)記。將自WT、M146L或E280A PSl穩(wěn)定細胞系分離的膜用于該研究。(d)通過將GY4和L646的標(biāo)記強度與JC8的標(biāo)記強度進行比較,來量化光標(biāo)記的PSl NTF0 (e)自M146V分離的Y-分泌酶或來自敲入小鼠腦的WT PSl的分析。使用抗PSl NTF抗體,用蛋白質(zhì)印跡分析檢測光標(biāo)記的PSl。(f)光標(biāo)記的PSl NTF的分析通過比較L646與JC8的標(biāo)記強度來量化。`
`[0047]圖11.PSl突變體更喜歡具有較大P2殘基的Nl-Sbl底物。(a)具有野生型P2殘基半胱氨酸的Nl-Sbl的圖示。(b)顯示了被丙氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸取代的野生型半胱氨酸殘基的相對大小差異。(c)得自穩(wěn)定細胞系的M146L、E280A和WT PSl用來確定或MNl-Sbl的催化。(d)比較WT和M146V PSl間的C和M Nl-Sbl的催化。(n=3,平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差 ***ρ〈0.001, **ρ〈0.01) ο
[0048]圖12.APP的WT PSl和FAD PSl切割的圖示。(a) Y -分泌酶在幾個位置處切割A(yù)PP,例如用于Αβ40和Αβ42產(chǎn)生的Y位點,以及產(chǎn)生Αβ 48和Αβ 49肽的ε位點。順序切割模型提出,¥-分泌酶先在八0 49位點切割4--,接著是40 4640 43和40 40 (綠色虛線),或Y -分泌酶可在A β 48位點切割ΑΡΡ,接著是A β 45和A β 42 (紅色虛線)。(b)在A β 40、A β 42/48或A β 49切割期間Ρ2殘基相對大小的比較。因為A β 42/40和A β 48/49比率的增加與FAD PSl有關(guān),這就表明較深的FAD PSl的S2亞口袋更喜歡具有較大Ρ2殘基(Ile)的Αβ 42和Αβ 48切割,而具有較淺的S2亞位點的WT PSl更喜歡具有較小Ρ2殘基(例如Val和Thr)的A β 40和A β 49切割。
[0049]發(fā)明詳述
本文所用術(shù)語“Notch蛋白”及相關(guān)術(shù)語和表述一般涉及存在于后生動物中的細胞表面受體的Notch家族的任何成員。哺乳動物具有4個不同的Notch受體,稱為N0TCH1、N0TCH2、N0TCH3和N0TCH4。人Notchl氨基酸序列的實例公開于GenBank登記號AAG33848.1(G1:11275980),并且復(fù)制于下表1中。
[0050]表1 (SEQ ID NO:1) ?
【權(quán)利要求】
1.一種測定Y-分泌酶的活性的方法,所述方法包括: 提供疑似含有Y-分泌酶活性的組合物; 使所述組合物與Y -分泌酶的多肽底物接觸,所述多肽底物包含與可檢測標(biāo)記結(jié)合的Notch底物,其中所述Notch底物被Y -分泌酶切割提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物; 使所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸: 包含第一標(biāo)簽的第一配體,其中所述第一配體特異性地結(jié)合可檢測標(biāo)記,和 包含第一標(biāo)簽的第二配體,其中所述第一配體特異性地結(jié)合可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和 測定與所述第一配體和與所述第二配體結(jié)合的可檢測標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況、量或其組口 ο
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述Notch底物包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述接觸發(fā)生在容器中。
4.權(quán)利要求3的方法,其中所述方法是在多個容器中進行的高通量測定方法。
5.權(quán)利要求4的方法,其中每個容器是多孔測定板中的孔,從而提供高通量的測定方法。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述可檢測標(biāo)記包含生物素。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述第一配體包含抗生物素蛋白,所述第一標(biāo)簽包含可檢測熒光接納體。
8.權(quán)利要求7的方法,其中所述第二配體包含特異性地結(jié)合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特異性地結(jié)合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗體,所述第一抗體與帶有熒光供體的第二抗體結(jié)合,所述熒光供體激發(fā)與所述第一配體結(jié)合的熒光接納體標(biāo)簽。
9.一種測定細胞中Y-分泌酶的活性的方法,所述方法包括: 提供疑似帶有Y-分泌酶活性的細胞; 使細胞與包含Y -分泌酶的多肽底物的培養(yǎng)基接觸,其中所述底物包含與可檢測標(biāo)記結(jié)合的Notch底物,其中通過Y -分泌酶切割標(biāo)記底物提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和測定所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況。
10.權(quán)利要求9的方法,其中所述測定包括: 在合適的孵育期后從培養(yǎng)基中分離細胞以提供上清液;和 測定所述上清液的標(biāo)記產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述測定還包括: 使所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸: 包含第一標(biāo)簽的第一配體,其中所述第一配體特異性地結(jié)合可檢測標(biāo)記,和 包含第二標(biāo)簽的第二配體,其中所述第二配體特異性地結(jié)合可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和 測定與所述第一配體和與所述第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況、量或其組合。
12.權(quán)利要求9的方法,其中所述培養(yǎng)基還包含去污劑。
13.權(quán)利要求9的方法,其中所述可檢測標(biāo)記包含生物素。
14.權(quán)利要求10的方法,其中測定所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物包括測定包含可檢測標(biāo)記產(chǎn)物和可檢測探針的可檢測復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述復(fù)合物包含含有第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員,其中所述第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物。
16.權(quán)利要求15的方法,其中所述第一探針包含釕。
17.權(quán)利要求9的方法,其中所述Notch底物包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求9的方法,其中所述接觸發(fā)生在容器中。
19.權(quán)利要求18的方法,其中所述方法是在多個容器中進行的高通量測定方法。
20.權(quán)利要求19的方法,其中每個容器是多孔測定板中的孔,從而提供高通量的測定方法。
21.權(quán)利要求11的方法,其中所述第一配體包含抗生物素蛋白,所述第一標(biāo)簽包含可檢測熒光接納體。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述第二配體包含特異性地結(jié)合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特異性地結(jié)合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗體,所述第一抗體與帶有熒光供體的第二抗體結(jié)合,所述熒光供體激發(fā)與所述第一配體結(jié)合的熒光接納體標(biāo)簽。
23.—種篩選Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的方法,所述方法包括: 提供包含Y-分泌酶活性的組合物; 使所述組合物與包含候選化合`物和Y-分泌酶的多肽底物的混合物接觸,其中所述底物包含與可檢測標(biāo)記結(jié)合的Notch底物,其中通過Y -分泌酶切割標(biāo)記底物提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和 測定所述候選化合物是否調(diào)節(jié)所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物的形成。
24.權(quán)利要求23的方法,其中所述Notch底物包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求23的方法,其中所述接觸發(fā)生在容器中。
26.權(quán)利要求25的方法,其中所述方法是在多個容器中進行的高通量測定方法。
27.權(quán)利要求26的方法,其中每個容器是多孔測定板中的孔,從而提供高通量的測定方法。
28.權(quán)利要求23的方法,其中所述可檢測標(biāo)記包含生物素。
29.權(quán)利要求23的方法,其中測定所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物包括測定包含產(chǎn)物和可檢測探針的可檢測復(fù)合物。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所述復(fù)合物包含含有第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員,其中所述第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合所述產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物。
31.權(quán)利要求30描述的方法,其中所述第一探針包含釕。
32.權(quán)利要求23描述的方法,其中所述測定還包括 使所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸: 包含第一標(biāo)簽的第一配體,其中所述第一配體特異性地結(jié)合標(biāo)記,和 包含第二標(biāo)簽的第二配體,其中所述第二配體特異性地結(jié)合產(chǎn)物;和 測定與所述第一配體和與所述第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況、量或其組合。
33.權(quán)利要求32的方法,其中所述第一配體包含抗生物素蛋白,所述第一標(biāo)簽包含可檢測熒光接納體。
34.權(quán)利要求32的方法,其中所述第二配體包含特異性地結(jié)合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特異性地結(jié)合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗體,所述第一抗體與帶有熒光供體的第二抗體結(jié)合,所述熒光供體激發(fā)與所述第一配體結(jié)合的熒光接納體標(biāo)簽。
35.一種篩選細胞的Y-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的方法,所述方法包括: 提供包含Y-分泌酶活性的細胞; 使所述細胞與包含候選化合物和Y -分泌酶的多肽底物的培養(yǎng)基接觸,其中所述底物包含與可檢測標(biāo)記結(jié)合的Notch底物,其中所述Notch底物被Y -分泌酶切割提供可檢測標(biāo)記產(chǎn)物;和 測定所述候選化合物是否調(diào)節(jié)所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物的形成。
36.權(quán)利要求35的方法,其中所述測定包括 在適當(dāng)孵育期后分離細胞以提供上清液;和 測定所述上清液以測定所述候選化合物是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)記產(chǎn)物的形成。
37.權(quán)利要求36的方法,其中所述測定還包括 使所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物與以下配體接觸: 帶有第一標(biāo)簽的第一配體,其中所述第一配體特異性地結(jié)合標(biāo)記,和 帶有第二標(biāo)簽的第二配體,其中所述第二配體特異性地結(jié)合產(chǎn)物;和 測定所述候選化合物是否調(diào)節(jié)與所述第一配體和與所述第二配體結(jié)合的標(biāo)記產(chǎn)物的存在情況和/或量。
38.權(quán)利要求35的方法,其中所述培養(yǎng)基還包含去污劑。
39.權(quán)利要求35的方法,其中所述可檢測標(biāo)記包含生物素。
40.權(quán)利要求36的方法,其中測定所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物包括測定包含可檢測標(biāo)記產(chǎn)物和可檢測探針的可檢測復(fù)合物。
41.權(quán)利要求40的方法,其中所述復(fù)合物包含含有第一可檢測探針的第一特異性結(jié)合成員,其中所述第一特異性結(jié)合成員特異性地結(jié)合所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)物以形成二元復(fù)合物。
42.權(quán)利要求41的方法,其中所述第一探針包含釕。
43.權(quán)利要求35的方法,其中所述Notch底物包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
44.權(quán)利要求35的方法,其中所述接觸發(fā)生在容器中。
45.權(quán)利要求44的方法,其中所述方法是在多個容器中進行的高通量測定方法。
46.權(quán)利要求45的方法,其中每個容器是多孔測定板中的孔,從而提供高通量的測定方法。
47.權(quán)利要求11的方法,其中所述第一配體包含抗生物素蛋白,所述第一標(biāo)簽包含可檢測熒光接納體。
48.權(quán)利要求37的方法,其中所述第二配體包含特異性地結(jié)合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特異性地結(jié)合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗體,所述第一抗體與帶有熒光供體的第二抗體結(jié)合,所述熒光供體激發(fā)與所述第一配體結(jié)合的熒光接納體標(biāo)簽。
49.一種試劑,其特異性地結(jié)合Notch底物在S3位點處的切割產(chǎn)物,所述切割在合適條件下被Y-分泌酶催化。
50.權(quán)利要求49的試劑,其中所述試劑包含抗體。
51.權(quán)利要求50的試劑,其中所述抗體特異性地結(jié)合VLLSRKRRR。
52.權(quán)利要求51的試劑,其中所述抗體通過用包含含有序列VLLSRKRRR的肽的組合物免疫宿主動物而獲得。
53.一種包含Notch底物的多肽底物,其中所述多肽底物包含第一標(biāo)記,且其中所述Notch底物的氨基酸序列可在合適條件被Y -分泌酶的活性切割以提供包含第一標(biāo)記的可檢測產(chǎn)物肽。
54.權(quán)利要求53的多肽底物,其中所述多肽底物還包含與Notch底物連接的標(biāo)簽。
55.權(quán)利要求53的多肽底物,其中所述第一標(biāo)記包含標(biāo)記性氨基酸序列,其可起反應(yīng)以使特定結(jié)合對的第一成員與所述`標(biāo)記性氨基酸序列連接。
【文檔編號】G01N33/68GK103502466SQ201180053657
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2010年9月7日
【發(fā)明者】李月明, 周德明, 詹尼弗·錢, 克里斯蒂娜·克倫普 申請人:斯?。瓌P特林紀(jì)念癌癥中心