久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

一種用于定量檢測fmdv有效抗原的反向液相阻斷elisa方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于定量檢測FMDV有效抗原的反向液相阻斷ELISA方法。本發(fā)明通過將標準陽性血清的稀釋方法固定，即固定血清抗體的量，將待檢抗原作系列稀釋與之作用，同時設置已知有效抗原含量的標準對照抗原，基于陽性血清在某一恒定的抗體效價下其50%阻斷有效抗原量是一定的這一抗原抗體反應原理，成功建立了一種對口蹄疫病毒有效抗原定量的新技術，命名為反向液相阻斷ELISA。該方法繼承了液相阻斷ELISA方法用于測定血清抗體時可分型、操作簡單、重復性好、高敏感性、高特異性、可批量檢測等優(yōu)點，同時實現(xiàn)了對FMDV的有效抗原量的定量測定，為解決現(xiàn)今國內(nèi)外急需解決的疫苗效力檢驗動物替代問題提供了技術手段。
【專利說明】—種用于定量檢測FMDV有效抗原的反向液相阻斷ELISA方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測FMDV有效抗原的新方法，特別涉及一種可用于分型、測定血清FMD抗體的液相阻斷ELISA檢測方法、一種可定量FMDV中146S抗原含量的蔗糖梯度離心方法以及標定血清抗體某一抗體效價下50%阻斷有效抗原量的方法。本發(fā)明屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大政治、經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報的傳染病，我國也將其列在一類動物傳染病的首位?？谔阋卟《?Foot and Mouth DiseaseVirus, FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬。目前已知口蹄疫病毒在全世界主要有七個血清型:0、A、亞洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之間交叉保護?，F(xiàn)階段我國主要針對O、A和亞洲I型進行疫苗免疫。
[0003]疫苗接種與撲殺相結(jié)合是發(fā)展中國家預防、控制乃至逐步消滅口蹄疫最為常用的手段。隨著新技術的發(fā)展，出現(xiàn)了以表位疫苗、類病毒樣顆粒、合成肽為代表的新型疫苗，但是傳統(tǒng)的口蹄疫滅活疫苗仍然在我國口蹄疫控制中發(fā)揮著主要作用?，F(xiàn)階段疫苗生產(chǎn)中口蹄疫病毒的繁殖已經(jīng)開始由傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶BHK21細胞單層培養(yǎng)法向BHK21細胞懸浮培養(yǎng)方法過渡，BHK21細胞懸浮培養(yǎng)方法由于其在病毒培養(yǎng)中的巨大優(yōu)勢引起了疫苗生產(chǎn)廠家的重視?？谔阋卟《局饕捎枚蚁﹣啺?BEI)滅活，病毒滅活徹底，并且滅活前后抗原含量變化小,免疫佐劑以油佐劑為主。
[0004]FMD疫苗的效力試驗主要采用本動物進行免疫攻毒試驗，即Η)50測定法:用疫苗50%動物保護劑量(PD50)來評價疫苗免疫效果，常規(guī)疫苗需至少達到3PD50，緊急接種疫苗需至少達到6PD50。目前，發(fā)達國家已經(jīng)采用本動物替代方法檢測FMD疫苗的效力，該檢測方法也是我國FMD疫苗生產(chǎn)急需解決的關鍵技術之一。FMD疫苗效力檢驗替代方法主要有疫苗抗原定量方法和血清學測定口蹄疫抗體替代法。
[0005]FMD疫苗抗原定量主要有免疫擴散法、間接夾心ELISA146S抗原定量法、蔗糖密度梯度離心法?？谔阋卟《究乖康姆椒壳俺Ｓ玫氖钦崽敲芏忍菪募兓?46S方法和間接夾心ELIA方法測定146S含量方法。蔗糖密度梯度離心純化測定完整病毒粒子(146S)含量是最常用的的方法。根據(jù)沉降系數(shù)不同，可以分為完整病毒粒子(146S)、空衣殼(76S)、病毒感染相關肽(45S)、小分子蛋白(12S)。146S抗原是口蹄疫疫苗中使動物肌體產(chǎn)生保護性抗體的主要免疫成分，因此146S抗原顆粒也被認為與口蹄疫疫苗的效力具有平行關系。1971年，F(xiàn)ayet等首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原顆粒的方法；1974年,Barreling等在此基礎上做了改進,使此方法更加精確敏感。Doel等進一步發(fā)展和標準化了這個方法，并于1982年向OIE正式推薦了這個方法。1990年，Junsuke等用蔗糖密度梯度離心法對口蹄疫滅活疫苗中的146S抗原顆粒純化后，用軟件CDS系統(tǒng)對146S抗原顆粒實現(xiàn)了電腦自動化定量。有研究者還開展了 146S抗原顆粒含量與疫苗的本動物效力(PD50)相關性的研究。試驗證明，在一定的范圍內(nèi)，146S抗原顆粒的含量與疫苗效力有相關性。
[0006]由于蔗糖密度梯度離心測定146S抗原不能區(qū)分血清型，而ELISA方法在技術操作要求、FMDV定型、批量檢測等方面具有優(yōu)勢，研究者一直探索用ELISA方法解決抗原定量問題。Van Maanen等1990年用針對VPl的單克隆抗體雙抗夾心ELISA法定量FMD疫苗的146S含量；Crowther等1995年利用診斷VPl的單克隆抗體建立能區(qū)分146S和12S的雙抗夾心法。單克隆抗體作為捕獲抗體不能完全辨別抗原的所有功能區(qū)域，不能完全反映抗原的免疫原性和本動物接種疫苗后一系列復雜的免疫反應；基于多克隆抗體建立的雙抗夾心ELISA，由于同型FMD毒株間存在許多亞型，要想定量準確，必須使捕獲抗體和檢測抗體與要檢測的抗原以及標準對照抗原同源，在未知被檢測的毒株來源的情況下，該方法也很不理想。
[0007]口蹄疫血清學效力檢測替代方法是通過檢測疫苗免疫后的抗體滴度水平來評價疫苗免疫效力，主要包括病毒中和試驗和液相阻斷ELISA試驗。1968年，Stellman等提出了用中和抗體滴度分析疫苗效力的統(tǒng)計學方法；到1976年，Pay等根據(jù)中和抗體滴度和疫苗效力的關系建立了疫苗的抗原劑量、中和抗體滴度和保護率的相關公式。馬軍武等通過液相阻斷ELISA檢測疫苗免疫抗體與攻毒保護分析確定了豬、牛、羊等口蹄疫免疫抗體與攻毒保護的關系。疫苗免疫血清抗體效價檢測須用非口蹄疫疫苗免疫動物，無法從根本上取代本動物的使用，陰性動物的選擇也存在困難。
[0008]口蹄疫滅活疫苗本動物效力檢驗替代方法的探索是國內(nèi)外面臨和亟待解決的一個問題，有效的替代方法應該具有很好的特異性、敏感性和重復性，而且要易于標準化。疫苗免疫效果主要是由疫苗中的有效抗原含量決定的，所以建立能科學準確測定疫苗中的有效抗原含量的方法是解決口蹄疫疫苗效力檢驗替代問題的關鍵。所謂有效抗原應為具有一定的免疫原性并且免疫產(chǎn)生的血清抗體具有一定的抗感染或攻毒保護的抗原。因此，有效抗原應包括完整病毒粒子(146S)、空衣殼(76S)和部分抗原肽。
[0009]本發(fā)明綜合分析了液相阻斷ELISA測定抗體、間接ELISA測定抗原量和病毒中和試驗等方法。液相阻斷ELISA方法測定抗體是在滿足檢測血清敏感性和特異性的條件下固定抗原的量，將待檢血清系列稀釋，從而測定血清抗體效價；經(jīng)典的病毒中和試驗提到可以固定抗原的量測定血清抗體的量，反之也可以通過固定血清的量測定抗原的滴度。我們從中得到啟發(fā)，把標準陽性血清的稀釋方法固定，將待檢抗原作系列稀釋與之作用，基于陽性血清在某一恒定的抗體效價下其50%阻斷有效抗原量是一定的這一抗原抗體反應原理，本發(fā)明成功建立了一種對口蹄疫病毒有效抗原定量的新技術，本發(fā)明將這種ELISA方法命名為反向液相阻斷ELISA。
[0010]作為FMDV抗原定量的反向液相阻斷ELISA方法，它繼承了液相阻斷ELISA方法用于測定血清抗體時可分型、操作簡單、重復性好、高敏感性、高特異性、可批量檢測等方便的所有優(yōu)點，實現(xiàn)了像測定血清抗體一樣測定FMDV的有效抗原量。利用該項技術本發(fā)明已經(jīng)初步建立起O、亞I和A型FMDV有效抗原定量的反向液相阻斷ELISA方法。口蹄疫病毒抗原含量測定反向液相阻斷ELISA方法的建立和應用可以解決現(xiàn)今國內(nèi)外急需解決的疫苗效力檢驗動物替代問題。
[0011]反向液相阻斷ELISA方法定量FMDV有效抗原量，在進一步試驗的基礎上可以解決一下幾個問題:通過與蔗糖密度梯度離心方法平行比較，可以確定完整病毒粒子(146S)含量與利用液相阻斷ELISA測定的有效抗原含量的關系；通過測定疫苗中有效抗原量與試驗動物攻毒保護的關系，可以確定疫苗有效抗原含量與50%動物保護劑量(PD50)的關系；通過測定疫苗中有效抗原量與免疫動物抗體水平的關系(合格率、保護率)，可以根據(jù)免疫有效抗原含量掌握動物疫苗免疫后群體抗體水平。同時通過口蹄疫病毒生產(chǎn)流程中，對每一個環(huán)節(jié)抗原量的監(jiān)測有利于持續(xù)改進提高優(yōu)化生產(chǎn)工藝；可以實現(xiàn)按有效抗原量進行單價苗(或多組份苗)、雙價及多價疫苗的配制；可以對疫苗儲藏、流通、免疫接種前各個階段進行有效抗原量監(jiān)測，確保疫苗的質(zhì)量和動物免疫的有效性；動物疫苗免疫可以實現(xiàn)按有效抗原量指導免疫。
[0012]因此反向液相阻斷ELISA測定口蹄疫病毒有效抗原量的方法必將在測定疫苗抗原含量、疫苗效力檢驗替代、疫苗免疫群體抗體水平評估、疫苗質(zhì)量控制、免疫指導等方面得到廣泛應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能夠定量口蹄疫病毒有效抗原的新方法-一反向液相阻斷ELISA方法，其基本原理是標準陽性血清在某一恒定的抗體效價下其50%阻斷有效抗原量是一定的。如果把標準陽性血清的稀釋方法固定，加入不同比例稀釋的待檢抗原(標準抗原以已知的最佳稀釋度稀釋)與之作用，每個稀釋度的抗原均設置不加血清的四孔抗原對照；同樣稀釋的陽性標準血清在其相同的抗體滴度下阻斷50%時的被檢抗原和標準對照抗原的有效抗原量是相同的。由于標準陽性血清抗體滴度的計算值是在一定范圍內(nèi)變化的，計算出的抗體滴度與對應抗原的有效抗原含量存在著反比例關系，被檢抗原的有效抗原含量等于被檢抗原對應的陽性標準血清的抗體滴度除以標準對照抗原對應的陽性標準血清的抗體滴度乘以(標準對照抗原的有效抗原含量/對應的稀釋倍數(shù))乘以待檢抗原對應的稀釋倍數(shù)。血清的具體抗體滴度按改進的reed-Meunch法計算。本發(fā)明將這種ELISA檢測技術命名為反向液相阻斷ELISA方法。與液相阻斷ELISA測定血清抗體的區(qū)別在于:液相阻斷ELISA方法測定抗體時是將滿足標準陽性血清抗體測定敏感性和特異性要求的有效抗原通過稀釋固定，去檢測被檢血清中的抗體滴度；反向液相阻斷ELISA是將已知抗體效價的陽性標準血清的稀釋方法固定，加入按不同稀釋度稀釋的被檢抗原，對變量、固定量及已知量與被檢測量的設置剛好是相反的。
[0014]本發(fā)明在國內(nèi)外率先突破了對液相阻斷ELISA方法的利用，克服了蔗糖密度梯度離心、間接夾心ELISA等方法定量146S抗原的不足。由于該方法操作簡單、可分型、經(jīng)濟有效，能快速、便捷、準確地測定出FMDV的有效抗原含量，是抗原定量和疫苗效力檢驗替代的最理想方法，必將會被廣泛應用。
[0015]為了達到該目的，本發(fā)明所采取的技術方案步驟如下:
[0016]1、FMDV陽性標準血清抗體效價的測定(液相阻斷ELIS方法)；
[0017]2、FMDV146S抗原的純化(蔗糖密度梯度離心法)；[0018]3、標準陽性血清阻斷50%FMDV有效抗原量的測定(146S)或以一般FMDV抗原作為標準對照抗原其有效抗原量的標定；
[0019]經(jīng)蔗糖密度離心純化的146S抗原標定過的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已確定就可以作為該方法的標準對照抗原。
[0020]5、血清抗體滴度的計算方法；
[0021]6、被檢抗原有效抗原量的計算方法(改進的reed-Meunch法)；
[0022]此外還可包括:
[0023]7、取值范圍的計算；
[0024]8、敏感性(準確檢測最低極限)和特異性分析。
[0025]具體的，本發(fā)明為一種用于定量檢測FMDV有效抗原的反向液相阻斷ELISA方法，其特征在于通過將標準陽性血清的稀釋方法固定以達到固定血清的量的目的，并將待檢抗原作系列稀釋與之作用，同時設置已知有效抗原含量的標準對照抗原，參考陽性標準血清在某一抗體效價下阻斷50%標準對照抗原的有效抗原量的測定結(jié)果，基于標準陽性血清在某一恒定的抗體效價下其50%阻斷有效抗原量是一定的這一抗原抗體反應原理，通過以下公式計算得到:
[0026]
【權利要求】
1.一種用于定量檢測FMDV有效抗原的反向液相阻斷ELISA方法，其特征在于通過將標準陽性血清的稀釋方法固定以達到固定血清的量的目的，并將待檢抗原作系列稀釋與之作用，同時設置已知有效抗原含量的標準對照抗原，參考陽性標準血清在某一抗體效價下阻斷50%標準對照抗原的有效抗原量的測定結(jié)果，基于標準陽性血清在某一恒定的抗體效價下其50%阻斷有效抗原量是一定的這一抗原抗體反應原理，通過以下公式計算得到:
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的標準對照抗原為已知有效抗原含量的抗原，包括純化的146S抗原,經(jīng)146S標定過的已知有效抗原含量的普通抗原。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的標準對照抗原為經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化得到的146S抗原。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，具體的包括以下步驟: (1)標準陽性血清抗體滴度測定； (2)FMDV 146S抗原的純化及含量測定； (3)標準陽性血清在其抗體滴度下阻斷50%時146S有效抗原量的測定； (4)待檢FMDV樣品有效抗原量的標定 a、包被ELISA板 用pH值9.60.05M碳酸鹽緩沖液將兔抗FMDV血清稀釋并包被ELISA板，室溫過夜，PBST洗板5次； b、按每孔50μ I量在 抗原抗體反應板上用pH值7.4的PBST將陽性標準血清按比例作2倍連續(xù)稀釋，按每孔50 μ I量在血清稀釋孔內(nèi)加入按不同比例稀釋的FMDV抗原以及作為標準對照抗原的146S抗原，不同濃度稀釋的待檢FMDV抗原和作為標準對照抗原的146S抗原均設4孔不加血清稀釋液的抗原作為對照，100 μ I/孔，其中146S抗原量為陽性標準血清在其抗體滴度下50%阻斷時146S抗原含量； C、洗板和轉(zhuǎn)移 將載體板上的抗原抗體混合物按次序平移至ELISA板上，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時；洗板，將與兔抗血清同源的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST稀釋至工作濃度，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時； d、酶促反應 洗板5次，加入用PBST稀釋的兔抗豚鼠IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時；洗板5次，加入底物溶液，50 μ I/孔，37°C孵育15分鐘，再每孔加入50 μ I量的1.25%H2S04終止反應，酶標儀492nm波長下讀取吸光值； (5)被檢FMDV抗原有效抗原量計算:
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于將所述的標準對照抗原替換為經(jīng)146S標定過的已知有效抗原含量的普通抗原，所述的普通抗原按照權利要求4中步驟(3)的方法標定。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，標準陽性血清阻斷50%時146S有效抗原量的測定是按照以下步驟進行的: a、包被ELISA板 用pH值9.60.05M碳酸鹽緩沖液將兔抗FMDV血清稀釋并包被ELISA板，室溫過夜，PBST洗板5次； b、抗原抗體反應 在抗原抗體反應板上用pH值7.4的PBST將陽性標準血清按比例作2倍連續(xù)稀釋，一般使得血清抗體滴度處于4個稀釋滴度的中間，按每孔50 μ I量在血清稀釋孔內(nèi)加入用PBST按不同比例稀釋的146S抗原以及已知有效抗原含量的抗原作為對照抗原；不同濃度稀釋的146S抗原和對照抗原均設4孔不加血清稀釋液的抗原作為對照，對照抗原加入量為標準陽性血清在其抗體滴度下阻斷50%對照抗原時的對照抗原的抗原含量，混勻后封板置4°C過夜； C、洗板和轉(zhuǎn)移 將載體板上的抗原抗體混合物按次序平移至ELISA板上，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時；洗板，將與兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST根據(jù)使用濃度進行稀釋，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時； d、酶促反應 洗板5次，加入用PBST稀釋 的兔抗豚鼠IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小時；洗板5次，加入底物溶液，50 μ I/孔，37°C孵育15分鐘，再每孔加入50 μ I量的1.25%H2S04終止反應，酶標儀492nm波長下讀取吸光值； 選取146S抗原對應抗體滴度與對照抗原對應的陽性標準血清抗體效價最為接近的濃度作為陽性標準血清在其抗體滴度下50%阻斷146S的有效抗原量，作為本方法最根本的標準對照抗原。
7.如權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述的FMDV抗原包括O型FMDV抗原，亞洲I型FMDV抗原以及A型FMDV抗原。
【文檔編號】G01N33/569GK103884839SQ201210555104
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權日:2012年12月19日
【發(fā)明者】周廣青, 馬軍武, 林密, 馮霞, 郭建宏, 何繼軍, 楊亞民, 蔣韜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所