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一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條及方法。試紙條包括試紙和微孔試劑，所述微孔試劑中凍干有膠體金標(biāo)記的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體；所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜、底板依次連接組成，所述反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。用本發(fā)明試紙條檢測鄰苯二甲酸二丁酯的方法簡單、快速、直觀、成本低、易推廣使用。
【專利說明】一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的試紙條及方法，具體涉及一種用于檢測白酒中鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于鄰苯二甲酸酯類，是目前國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)中使用最多的塑化劑(又稱增塑劑)，廣泛存在于食品包裝、化妝品、醫(yī)療器材以及環(huán)境水體中。這類塑化劑并非食品或食品添加物，但會通過環(huán)境遷移、食品包裝遷移及非法添加等進(jìn)入食品，對人體健康產(chǎn)生毒害作用，如造成內(nèi)分泌失調(diào)，影響正常生育能力，在體內(nèi)長期蓄積會導(dǎo)致畸形、癌變和突變，對心血管、消化和泌尿系統(tǒng)也有很大傷害。因此，我國衛(wèi)生部衛(wèi)辦監(jiān)督函〔2011〕551號文件中規(guī)定:嚴(yán)禁在食品、食品添加劑中人為添加鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二( α -乙基已酯)(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大殘留量分別為1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。
[0003]目前文獻(xiàn)報道有關(guān)鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的檢測方法有氣相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-離子阱質(zhì)譜法等。但研究大多集中于環(huán)境樣品和塑料包裝材料，對于食品中的污染情況檢測研究較少。我國食品中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21911-2008食品中鄰苯二甲酸酯的測定”，包裝中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21928-2008食品塑料包裝材料中鄰苯二甲酸酯的測定”，兩種檢測方法均運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的方法進(jìn)行測定。該方法靈敏、準(zhǔn)確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復(fù)雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現(xiàn)場操作，而且需專業(yè)人員操作，所以限制了其應(yīng)用。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)將酶聯(lián)免疫反應(yīng)與生物技術(shù)相結(jié)合用于食品中藥物殘留的檢測，常以ELISA檢測試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化，逐漸發(fā)展成為食品中殘留物含量檢測中最實用的檢測技術(shù)之一。膠體金免疫層析法與酶聯(lián)免疫法相比檢測時間更短，操作簡便、成本低廉、無需其他儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀，適用于進(jìn)行現(xiàn)場快速篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條。
[0005]本發(fā)明所提供的膠體金試紙條包括試紙、微孔試劑，微孔試劑具有微孔塞，微孔試劑中凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板；反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀，檢測區(qū)包被有鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體。
[0006]所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由鄰苯二甲酸二丁酯半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述半抗原是由鄰苯二甲酸酐與正丁醇反應(yīng)得到鄰苯二甲酸單丁酯，然后再和氨基丁酸縮合得全新的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白。
[0007]所述鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體。
[0008]所述保護(hù)膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。
[0009]所述檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
[0010]所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊為全血濾血膜；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述膠體金試紙條的方法，其包括步驟:
[0012]I)制備凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0013]2)制備具有包被鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；
[0014]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0015]4)將I)和3)制備好的凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0016]具體地說,步驟包括:
[0017]I)制備鄰苯二甲酸二丁酯半抗原；
[0018]2)將鄰苯二甲酸二丁酯半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；
[0019]3)用鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0020]4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0021]5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
[0022]6)將制備的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
[0023]7)將鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上微孔塞；
[0024]8)將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%體積百分含量)、PH為7.2、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h ；
[0025]9)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜；
[0026]10)將制備好的微孔試劑、試紙組裝成試紙條，2?8°C條件下保存12個月。
[0027]本發(fā)明的另一個目的是提供一種應(yīng)用上述膠體金試紙條檢測白酒中鄰苯二甲酸二丁酯殘留的方法，它包括步驟:
[0028]( I)樣本前處理；
[0029](2)用試紙條進(jìn)行檢測；
[0030]( 3 )分析檢測結(jié)果。
[0031]本發(fā)明中用試紙條檢測樣品時，將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將標(biāo)有MAX標(biāo)記線端向下，插入孵育后的微孔試劑，待檢樣品液與微孔中的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起向反應(yīng)I吳擴散；若待檢樣品液中鄰本二甲Ife二丁酷的含量高，則擴散過程中待檢樣品液中的鄰苯二甲酸二丁酯可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金標(biāo)抗體上鄰苯二甲酸二丁酯的抗原結(jié)合點，阻止金標(biāo)抗體與反應(yīng)膜上鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測區(qū)不顯色或檢測區(qū)顯色明顯弱于質(zhì)控區(qū)，而抗抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色；若待檢樣品液中鄰苯二甲酸二丁酯的含量低或無，則金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會與反應(yīng)膜上鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測區(qū)顯色強于質(zhì)控區(qū)或與質(zhì)控區(qū)顯色無明顯差異，同時抗抗體也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色。如果質(zhì)控區(qū)不顯色，則試紙失效。如圖4a、4b、4c、4d、4e、4f所示。
[0032]陰性:檢測區(qū)T線顯色強于質(zhì)控區(qū)C線或與C線顯色無明顯差異，表示白酒樣本中不含有DBP或濃度低于檢測限，判為陰性，用“一”表示。
[0033]陽性:T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色，表示白酒樣本中DBP濃度等于或高于檢測限。判為陽性，用“ + ”表示。
[0034]無效:未出現(xiàn)C線，試紙失效。
[0035]本發(fā)明采用將高特異性的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。本發(fā)明的試紙條具有快速、直觀、操作簡單、成本低等優(yōu)點。用本發(fā)明的試紙條檢測白酒中的鄰苯二甲酸二丁酯，方法簡便、快速、直觀、成本低、易推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037]圖2為試紙俯視圖。
[0038]圖3為微孔試劑圖。
[0039]圖4a、4b、4c、4d、4e、4f為試紙檢測結(jié)果判定圖。
[0040]圖5為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原合成路線圖。
[0041]圖6為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原核磁共振氫譜圖。
【具體實施方式】
[0042]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043]實施例1檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條的構(gòu)成
[0044]一、試紙(圖1)
[0045]所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜組成；
[0046]所述樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序粘貼在底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
[0047]所述試紙 的樣品吸收墊端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜7覆蓋在樣品吸收墊上的檢測端，在檢測端保護(hù)膜上印有MAX字樣(圖2)；
[0048]所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5，均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀，檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。檢測區(qū)包被有鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體；
[0049]所述底板為PVC底板；所述樣品吸收墊為全血濾血膜；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0050]二、微孔試劑(圖3)
[0051]所述微孔試劑8具有微孔塞9，微孔試劑中凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0052]將上述試紙、微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C環(huán)境中保存，有效期12個月。
[0053]實施例2實施例1中所述的膠體金試紙條的制備方法
[0054]一、試紙條的制備
[0055]試紙條的制備方法主要包括以下步驟:
[0056]I)制備凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0057]2)制備具有包被鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；
[0058]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0059]4)將I)和3)制備好的凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0060]下面分步詳細(xì)敘述:
[0061](一)各部件的制備
[0062]1.鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定
[0063](I)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的合成和鑒定
[0064]半抗原的合成(合成路線如圖5 )
[0065]將1.48g鄰苯二甲酸酐溶入50ml三氯甲烷中，攪拌下滴加入3ml 1，8_ 二氮雜二環(huán)[5.4.0] 十一碳-7-烯(DBU)和1.0ml正丁醇在IOml三氯甲烷中的混合液，室溫攪拌6h，蒸除溶劑后，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單丁酯；將1.1lg鄰苯二甲酸單丁酯溶入40ml三氯甲烷中，加入2.06g 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，攪拌下緩慢滴加入0.8g 4-氨基丁酸在20ml三氯甲烷中的懸浮物，加畢繼續(xù)室溫反應(yīng)8h，過濾，水洗，蒸干溶劑后柱層析純化得到鄰丁氧?；榷』郊柞０?，即為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原。
[0066]半抗原的鑒定
[0067]取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖6所示，12.0ppm左右的羧基信號峰，
8.5ppm左右的亞氨基信號峰,8.0ppm左右的兩組芳環(huán)信號峰以及0.8-4.3ppm的烷基信號峰說明半抗原合成成功。
[0068](2)免疫原的制備
[0069]取IOmg半抗原,溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)中；取15mg碳化二亞胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取牛血清白蛋白(BSA)30mg，使之充分溶解在3ml 0.lmol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CB)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h,用0.01mol/L PBS 4°C透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070](3)包被原的制備[0071]取IOmg半抗原，溶解于Iml DMF中；取15mg EDC用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取卵清白蛋白(OVA) 30mg，使之充分溶解在3ml 0.lmol/L CB (pH 9.6)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h,用0.01mol/L PBS 4°C透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072]2.鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的制備
[0073]( I)動物免疫
[0074]將上述得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0075](2)細(xì)胞融合和克隆化
[0076]小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0077](3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0078]將單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成I X IO6個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0079](4)單克隆抗 體的制備與純化
[0080]將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，_20°C保存。
[0081]3.羊抗鼠抗抗體的制備
[0082]以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
[0083]4.鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0084](I)膠體金的制備
[0085]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01% (質(zhì)量百分含量)，取100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0086](2)鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0087]在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入20-50 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻IOminJpA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0088]復(fù)溶緩沖液:含牛血清白蛋白(BSA) 0.29Π).5% (體積百分含量)、吐溫_80
0.05%~0.2% (質(zhì)量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0089]5.將鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上[0090]向微孔試劑微孔板中加入50 μ I鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞，密封保存。
[0091]6.樣品吸收墊的制備
[0092]將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%(體積百分含量))、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。
[0093]7.反應(yīng)膜的制備
[0094]包被過程:用磷酸緩沖液將鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物稀釋到lmg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)，包被量為1.0 μ 1/cm;用0.0lmol/L、ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)(C)，包被量為1.0 μ Ι/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥8h，備用。
[0095](二)各部件的組裝
[0096]1.試紙的組裝
[0097]將所述樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次按順序粘貼在所述底板上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；在組裝好的試紙樣品吸收墊上粘貼保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線。
[0098]2.試紙條的組裝
[0099]將上述步驟I得到的試紙與微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C的環(huán)境中貯存，有效期12個月。
[0100]實施例3白酒中鄰苯二甲酸二丁酯的檢測
[0101]1.樣本前處理方法
[0102]移取50 μ I白酒樣品于IOml玻璃離心管中，再加入450 μ I樣本稀釋液(pH值為
7.0,0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液)，充分振蕩混勻，待檢。
[0103]2.用試紙條檢測樣品
[0104]從原包裝中取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙，并做好標(biāo)記；用微量移液器移取200 μ I稀釋后的待檢溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；將印有“MAX”線端朝下插入微孔中，使之充分浸入溶液中；室溫(20°C -25°C)孵育5min后，取出試紙，判定結(jié)果。
[0105]3.檢測結(jié)果分析
[0106]陰性:檢測區(qū)T線顯色強于質(zhì)控區(qū)C線或與C線顯色無明顯差異，表示白酒樣本中不含有DBP或濃度低于檢測限，判為陰性，用“一 ”表示，如圖4a和4b所示；
[0107]陽性:T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色，表示白酒樣本中DBP濃度等于或高于檢測限。判為陽性，用“ + ”表示，如圖4c和4d所示；
[0108]無效:未出現(xiàn)C線，試紙失效，如圖4e和4f所示。
[0109]實施例4試紙條技術(shù)參數(shù)的確定
[0110]1.檢測限試驗[0111]向空白白酒樣本中分別添加鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為0、150、300、600 μ g/L，用試紙條進(jìn)行白酒樣本檢測，結(jié)果為:當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品濃度為O、150 μ g/L時，試紙顯示出T線顯色與C線顯色無明顯差異，呈陰性；當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品濃度為300、600 μ g/L時，試紙C線顯色T線不顯色，呈陽性，表明本試紙條對白酒樣本中鄰苯二甲酸二丁酯檢測限為300 μ g/L。
[0112]2.假陽性率、假陰性率試驗
[0113]取已知鄰苯二甲酸二丁酯含量大于300 μ g/L的白酒陽性樣本20份和鄰苯二甲酸二丁酯含量小于300 μ g/L的白酒陰性樣本20份，用3個批次生產(chǎn)的試紙條分別進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1、表2。
[0114]表1檢測陽性樣本結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯的膠體金試紙條，其特征在于包括試紙和微孔試劑，所述微孔試劑中凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板，所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀，檢測區(qū)包被有鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次粘貼在底板上組成，所述微孔試劑上具有微孔塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金試紙，其特征在于所述保護(hù)膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由鄰苯二甲酸酐與正丁醇反應(yīng)得到鄰苯二甲酸單丁酯，然后再和氨基丁酸縮合得全新的鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備獲得偶聯(lián)物，所述載體蛋白可為卵清白蛋白、牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的。
7.一種制備權(quán)利要求1-6任一項所述的膠體金試紙條的方法，其包括步驟: O制備凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑； 2)制備具有包被鄰苯二甲酸二丁酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜； 3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙； 4)將I)和3)制備好的凍干有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
8.—種檢測白酒中鄰苯二甲酸二丁酯殘留的方法，其包括步驟: 1)樣本前處理； 2)用權(quán)利要求1-6任一項所述的膠體金試紙條進(jìn)行檢測； 3)分析檢測結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/532GK103869076SQ201210543777
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 田甜, 羅曉琴, 楊學(xué)林, 馮靜 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司