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一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法。利用硫化氫與對(duì)氨基二甲基苯胺及三氯化鐵作用，形成疏水性的亞甲基藍(lán)，通過(guò)分散液液微萃取，既分離了尿液、血液基體對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，又進(jìn)行富集，提高了檢測(cè)的靈敏度。所加入乙腈消除基體干擾，同時(shí)起到分散液液微萃取中分散劑的作用，萃取效果好，富集倍數(shù)大，檢測(cè)限可達(dá)到0.02μg/mL。方法具有準(zhǔn)確度高、檢測(cè)樣本量大、檢測(cè)樣品量少、檢測(cè)效率高等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于體內(nèi)藥物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法。 【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)源性硫化氫(H2S)是一種新近發(fā)現(xiàn)的氣體信號(hào)分子，對(duì)神經(jīng)、心血管、消化、呼吸、代謝以及生殖系統(tǒng)的生理功能具有重要的調(diào)節(jié)意義，而且參與這些系統(tǒng)的許多疾病的病理生理調(diào)節(jié)，尤其與心血管系統(tǒng)緊密相連，拓展了 H2S在心血管系統(tǒng)的藥理學(xué)領(lǐng)域，以H2S為靶點(diǎn)的治療具有潛在的臨床應(yīng)用前景。越來(lái)越多的證據(jù)表明內(nèi)源性H2S與多種疾病有著密切的關(guān)系，在臨床多種疾病中，內(nèi)源性H2S的生成和代謝發(fā)生了改變，并進(jìn)一步影響了疾病的發(fā)展過(guò)程。一種可靠、準(zhǔn)確的血液、尿液中內(nèi)源性H2S的測(cè)定方法對(duì)監(jiān)測(cè)體內(nèi)H2S含量及相關(guān)疾病的預(yù)測(cè)及診斷有重要意義。
[0003]H2S檢測(cè)方法主要包括亞甲基蘭分光光度法、硫離子選擇電極法、熒光衍生法、氣相色譜法、熒光探針及免疫分析法等。目前現(xiàn)有H2S檢測(cè)技術(shù)主要集中在大氣、水等環(huán)境樣品中。其檢測(cè)靈敏度在lmg/kg，而體內(nèi)內(nèi)源性硫化氫(H2S)含量在Mmol級(jí)，且基體干擾大及樣品量少等影響，目前沒(méi)有成熟檢測(cè)技術(shù)及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種穩(wěn)定性好、干擾小、準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定血液及尿液中硫化氫含量的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0006]除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
[0007]一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)硫化氫標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作:分別取S2-濃度為Wg/mL的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸懼水稀釋至5mL,搖勻,放置20min。于波長(zhǎng)665nm處,測(cè)定吸光度，制作工作曲線，得到硫化氫的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率；
(2)樣品檢測(cè):
尿液的檢測(cè):取5mL尿液，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機(jī)溶劑萃取劑300μ?，加入乙腈0.5~2mL，渦旋混合lmin，離心，分相，將有機(jī)溶劑萃取劑取出，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出樣品中硫化氫的含量；
血液的檢測(cè):取5mL新鮮血液，放入離心機(jī)中離心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，離心分離，取上清液2mL，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機(jī)溶劑萃取劑300μ?,潤(rùn)旋混合lmin,離心,分相,將有機(jī)溶劑萃取劑取出，于波長(zhǎng)665nm處,測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出樣品中硫化氫的含量；
其中，步驟(1) (2)中所述的0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺為0.1g對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于50mL 6mol/L鹽酸；三氯化鐵溶液為25g三氯化鐵溶于50mL蒸餾水中；有機(jī)萃取劑包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一種；分散劑包括甲醇、乙腈、丙酮中之一種；離心時(shí)間 10-25min，離心速率 3000-8000r / min。
[0008]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
1、通過(guò)硫化氫與三氯化鐵及對(duì)氨基二甲基苯胺作用，形成疏水性的亞甲基藍(lán)，利用分散液液微萃取技術(shù)萃取亞甲基藍(lán)，既分離了三價(jià)鐵離子、尿液、血液基體對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，又進(jìn)行富集，提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)到0.02Pg/mL。
[0009]2、通過(guò)加入乙腈消除基體干擾，同時(shí)起到分散液液微萃取中分散劑的作用，萃取效果好，富集倍數(shù)大。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0011]實(shí)施例1
利用本發(fā)明檢測(cè)人 體尿液中硫化氫的含量。
[0012]1、硫化氫標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作:分別取S2I農(nóng)度為lPg/mL的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機(jī)溶劑萃取劑30(^L，乙腈0.5mL，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度，得到線性回歸方程y=0.5805x+0.0015，相關(guān)系數(shù)R2=0.9980，6次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=L 21、回收率=94.5% ；
2、尿液的檢測(cè):取5mL尿液，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入三氯甲烷300μ?,乙腈0.5mL,潤(rùn)旋混合lmin,4000r / min離心IOmin,分相,取出管底三氯甲燒,于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度為0.031，代入步驟(1)所得的線性回歸方程，計(jì)算出尿液中硫化氫的含量為0.053Pg/mL。
[0013]實(shí)施例2
利用本發(fā)明檢測(cè)人體血液中硫化氫的含量。
[0014]1.按實(shí)施例1制作硫化氫標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0015]2.血液的檢測(cè):取5mL新鮮血液,放入離心機(jī)中，離心6000r / min離心20min,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 5000r / min離心IOmin,取上清液2mL,加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL,搖勻，放置20min。加入四氯化碳300μ?,潤(rùn)旋混合lmin, 3500r / min離心12min,分相，取出管底四氯化碳，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度為0.028，代入步驟(1)所得的線性回歸方程，計(jì)算出血液中硫化氫的含量為0.(MOPg/mL。
[0016]實(shí)施例3
利用本發(fā)明檢測(cè)人體血液中硫化氫的含量。
[0017]1.按實(shí)施例1制作硫化氫標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0018]2.血液的檢測(cè):取5mL新鮮血液,放入離心機(jī)中，離心8000r / min離心IOmin,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 6000r / min離心5min,取上清液2mL,加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μL，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL,搖勻，放置20min。加入二氯化碳300μ?,潤(rùn)旋混合lmin,5000r / min離心5min,分相，取出管底二氯化碳，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度為0.026，代入步驟(1)所得的線性回歸方程,計(jì)算出血液中硫化氫 的含量 為0.043Pg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種血液及尿液中硫化氫的檢測(cè)方法，包括以下步驟: (1)硫化氫標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作:分別取S2-濃度為Wg/mL的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度，制作工作曲線，得到硫化氫的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率； (2)樣品檢測(cè): 尿液的檢測(cè):取5mL尿液，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，加入有機(jī)溶劑萃取劑300μ?，乙腈0.5 mL,渦旋混合lmin，離心，分相，將有機(jī)溶劑萃取劑取出，于波長(zhǎng)665nm處，測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出樣品中硫化氫的含量； 血液的檢測(cè):取5mL新鮮血液，放入離心機(jī)中離心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，離心分離，取上清液2mL，加入0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉(zhuǎn)均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，加入有機(jī)溶劑萃取劑300μ?,潤(rùn)旋混合lmin,離心,分相,將有機(jī)溶劑萃取劑取出，于波長(zhǎng)665nm處,測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出樣 品中硫化氫的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的0.2%對(duì)氨基二甲基苯胺為0.1g對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于50mL 6mol/L鹽酸。
3.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的50%三氯化鐵溶液為25g三氯化鐵溶于50mL蒸餾水中。
4.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:分散劑包括甲醇、乙腈、丙酮中之一種。
5.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的有機(jī)萃取劑包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一種。
6.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的離心時(shí)間10-25min，離心速率3000-8000r / min0
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103776786SQ201410062197
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月22日
【發(fā)明者】楊亞玲, 趙嬌, 寧金艷, 王軍, 呂云輝 申請(qǐng)人:云南健牛生物科技有限公司