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用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，還涉及該傳感器的制備方法和應(yīng)用，該適配子型生物傳感器包括壓電基底、反射柵陣列和叉指換能器，所述壓電基底上依次附著有鉻膜和金膜，所述金膜表面包被有適配子，所述適配子為堿基序列如ＳＥＱＩ?ＤＮＯ：1所示的寡核苷酸單鏈。本發(fā)明建立了一種高靈敏性、高特異性和高親和力的適配子型生物傳感器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的快速檢測(cè)，可輔助用于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷。
【專利說明】用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，還涉及該傳感器的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是直接威脅人類生命健康的重要致死性疾病，近年來其發(fā)病率逐漸上升，預(yù)計(jì)到2030年因腫瘤死亡的人數(shù)將達(dá)到1500萬。研究證實(shí)，惡性腫瘤患者死亡的最主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，其占腫瘤相關(guān)死亡的90%。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟多因素的復(fù)雜過程，腫瘤細(xì)胞在原發(fā)灶侵襲、脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，大部分腫瘤細(xì)胞由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)的識(shí)別，殺傷及自身凋亡在短期內(nèi)死亡，只有極少數(shù)存活下來轉(zhuǎn)移到血液、骨髓、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官，發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。腫瘤轉(zhuǎn)移在疾病的分期、治療及進(jìn)展中發(fā)揮著決定性的作用，因此，腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的判斷至關(guān)重要，并對(duì)指導(dǎo)臨床治療有重大意義。
[0003]循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)是自發(fā)或因診療操作過程中由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。研究證實(shí)=CTCs存在于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌及卵巢癌中，并且與患者的臨床分期、患者生存期、腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療效果密切相關(guān)。與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)方法、影像學(xué)表現(xiàn)及腫瘤血清學(xué)標(biāo)志物相t匕，由于外周血液獲取容易且相對(duì)無創(chuàng)，CTCs被認(rèn)為是實(shí)時(shí)的“液體活檢”，其為腫瘤早期診斷和療效的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了新的方向。但是，外周血循環(huán)中CTCs數(shù)目極少，腫瘤患者血液中每IO6-1O7個(gè)白細(xì)胞中含有I個(gè)CTC，并且CTCs釋放入血呈現(xiàn)不連續(xù)性和異質(zhì)性，這使得CTCs快速、靈敏的檢測(cè)一直受到挑戰(zhàn)。因此，迫切需要發(fā)展一種靈敏度高、特異性好、無需標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作簡(jiǎn)單的CTCs檢測(cè)方法。
[0004]目前，CTCs的檢測(cè)包括富集和檢測(cè)兩個(gè)步驟，其中為了實(shí)現(xiàn)CTCs的檢測(cè)主要包括以下兩種策略:①免疫表型的分析方法(CellSearch，EPISPOT，CTC-chip等)，②通過PCR擴(kuò)增惡性細(xì)胞突變的方法。但是這些方法由于需特殊檢測(cè)儀器和操作復(fù)雜而受限，同時(shí)技術(shù)上需要熒光或生物學(xué)標(biāo)記，且結(jié)果存在重復(fù)性差，假陽性，難以標(biāo)準(zhǔn)化判定等問題。
[0005]生物傳感器(biosensor)是對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，由固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等等)及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。生物傳感器由于集高效、靈敏、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)于一身，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，隨著聲光、微電子技術(shù)
的發(fā)展，一種新型傳感器-漏聲表面波(Leaky Surface Acoustic Wave, LSAW)傳感器逐
漸發(fā)展起來。它利用了壓電晶體的特殊切向(如:Y方向切割36°旋轉(zhuǎn)、X方向傳播的LiTaO3晶體)激勵(lì)出LSAW，當(dāng)LSAW傳播路徑表面的質(zhì)量負(fù)載發(fā)生微小改變時(shí)(靶序列與固定的探針發(fā)生反應(yīng))，傳感器表面的邊界條件將發(fā)生改變，導(dǎo)致LSAW傳播的頻率和相位發(fā)生相應(yīng)的改變，此時(shí)從傳感器輸出換能器提取的電信號(hào)的頻率和相位即可隨之發(fā)生變化，從而可極為敏感地探測(cè)出與傳感器晶體表面固定的探針發(fā)生特異性反應(yīng)的待測(cè)靶物質(zhì)。總體上講，LSAff傳感器具有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)高靈敏度，高精度；2)重復(fù)性及可靠性更好；3)功耗低；4)結(jié)構(gòu)工藝性好。這使LSAW傳感器具有了非常廣泛的應(yīng)用前景。
[0006]適配子(aptamer)是通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的DNA或RNA核酸序列。SELEX是一種從大容量寡核苷酸文庫(kù)中經(jīng)反復(fù)分離擴(kuò)增步驟得到針對(duì)靶分子的高親和力高特異性核酸配基一適配子的體外篩選技術(shù)，主要包括結(jié)合、分離、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)五個(gè)步驟。首先將包含有IO13-1O15個(gè)隨機(jī)序列的核苷酸序列庫(kù)(ssDNA文庫(kù)、RNA文庫(kù))與靶分子混合溫育，隨后通過物理方法分離出結(jié)合了靶分子的核苷酸序列。洗脫收集獲得結(jié)合序列，并將結(jié)合序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增生成次級(jí)文庫(kù)，用于下輪篩選。一幫通過6-20輪SELEX循環(huán)，對(duì)已達(dá)到高親和力的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，從而獲得特異性識(shí)別靶分子的適配子。
[0007]在生物傳感器的構(gòu)建方面，適配子可以高特異性和親和力的識(shí)別靶分子，其與靶分子結(jié)合的解離常數(shù)可達(dá)到10_9_10_12 ;同時(shí)適配子還具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好、可反復(fù)使用和長(zhǎng)期保存、篩選周期很短、對(duì)溫度不敏感、變性之后還可以復(fù)性而恢復(fù)原來的三維結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢(shì)，是一種高效、快速的檢測(cè)手段。另外，適配子還具有一些優(yōu)于抗體的優(yōu)點(diǎn):1)適配體是通過體外篩選獲得，如SELEX篩選周期一般為2-3個(gè)月，最快的只需2周，而制備單克隆抗體則至少需要3-6個(gè)月，且成本昂貴；2)適配子是通過化學(xué)法合成的，因而可以在適配子上靈活修飾多種基因，使其具有多種功能；3)抗體的蛋白質(zhì)決定了它容易變性，傳統(tǒng)免疫生 物傳感器化學(xué)和物理性質(zhì)的不穩(wěn)定限制了生物傳感器的應(yīng)用范圍，而適配子具有化學(xué)穩(wěn)定性，在PH2-12的寬范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，并具有一定的熱復(fù)性；4)適配子組成簡(jiǎn)單，一般由幾十個(gè)核苷酸(少于IOOnt)組成，因而適配子的設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單。由于適配子擁有抗體無法比擬的優(yōu)勢(shì)，利用適配子設(shè)計(jì)生物傳感器對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)，具有極其重要的意義。
[0008]基于以上理論，本發(fā)明結(jié)合生物傳感器的高靈敏性和適配子的高特異性和高親和力，建立一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，以滿足對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移早期判定的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]有鑒于此，本發(fā)明首先提供一種可高特異性和高親和力的識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的適配子，即堿基序列如S E QIDNO:1所示的單鏈寡核苷酸。該單鏈寡核苷酸通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到。其篩選過程采用完整的MCF-7細(xì)胞作為復(fù)合靶分子，并采用Romas細(xì)胞和K562細(xì)胞進(jìn)行反向、消減篩選，故對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有高特異性和高親和力，特別適合作為適配子用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的生物傳感器。
[0010]本發(fā)明的目的就在于上述的單鏈寡核苷酸在用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供一種高靈敏性、高特異性和高親和力的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0012]用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，包括壓電基底、反射柵陣列和叉指換能器，所述壓電基底上依次附著有鉻膜和金膜，所述金膜表面包被有適配子，所述適配子為堿基序列如S EQIDNO:!所示的單鏈寡核苷酸。本發(fā)明的單鏈寡核苷酸作為適配子用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，并不限于上述生物傳感器的構(gòu)成，現(xiàn)有技術(shù)中已有的生物傳感器構(gòu)成均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0013]進(jìn)一步,所述適配子最小自由能為-5.20kcal/mol,其二級(jí)構(gòu)象結(jié)構(gòu)如下式所示:
[0014]
【權(quán)利要求】
1.用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，包括壓電基底(1)、反射柵陣列和叉指換能器，其特征在于:所述壓電基底(1)上依次附著有鉻膜(2)和金膜(3)，所述金膜(3)表面包被有適配子(4)，所述適配子(4)為堿基序列如S E Q I DNO:1所示的單鏈寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，其特征在于:所述適配子(4)最小自由能為-5.20kcal/moL.
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，其特征在于:所述壓電基底(1)采用Y36°切X傳方向的LiTaO3晶體制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器，其特征在于:所述金膜(3)厚度為40nm。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: A、生物傳感器的預(yù)處理:金膜表面在包被適配子前，對(duì)其進(jìn)行清潔處理，去除金膜表面的雜質(zhì)； B、適配子的預(yù)處理:所述適配子在95°C變性5min,然后迅速冰浴5min； C、適配子的包被:采用巰基法將適配子固定于金膜表面，再用6-巰基-1-己醇對(duì)未與適配子結(jié)合的金膜進(jìn)行封閉處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述步驟A生物傳感器的預(yù)處理是金膜表面在包被適配子前，先后分別用Piranha溶液、lmol/L NaOH和lmol/L HCl各浸泡生物傳感器金膜lOmin，然后用磷酸鹽緩沖液和去離子水分別清洗生物傳感器3次，氮?dú)獯蹈伞?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述步驟B適配子的預(yù)處理是將適配子溶解于包含 10mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTAUmoI/L NaCl 和 lmmol/L TCEP 的緩沖液中，并在95°C變性5min，然后迅速冰浴5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述步驟C適配子包被時(shí)，適配子的濃度為2 4!1101/1,包被操作于4°(:反應(yīng)24h。
9.快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: a、將權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器表面的適配子與循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)條件為在包含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖液中，于37°C反應(yīng)30min，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4 ; b、由生物傳感器的相位變化獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)。
10.堿基序列如SEQIDNO:1所示的單鏈寡核苷酸在用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速檢測(cè)的適配子型生物傳感器中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103713130SQ201310711267
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】唱?jiǎng)P, 陳鳴, 皮燕, 鄧少麗, 魯衛(wèi)平, 王豐, 賈雙榮, 李發(fā)科 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院