久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

Gc-ms研究灰葡萄孢菌代謝組的樣品前處理及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)研究灰葡萄孢菌代謝組的樣品前處理方法和代謝組檢測方法。本發(fā)明提供的對灰葡萄孢菌樣品前處理方法如下：在鋪有玻璃紙的PDA平板上培養(yǎng)灰葡萄孢菌，培養(yǎng)2～4d(優(yōu)選3d)后收集菌絲，液氮滅活后超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＠鋬鲅心テ扑榫z樣品，代謝組提取采用冷凍過的甲醇水混合物以使酶失活。離心干燥后，經(jīng)過肟化(或腙化)和硅烷化兩步衍生化反應后用于GC-MS檢測。本發(fā)明還提供了利用GC-MS對上述樣品進行的檢測方法，檢測條件如下：選用HP-5MS毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；進樣量1μL；程序升溫；離子源溫度230℃，全掃描范圍m/z20～650。采用本發(fā)明的提取及檢測方法能得到重現(xiàn)性較好的代謝組檢測結(jié)果。
【專利說明】GC-MS研究灰葡萄孢菌代謝組的樣品前處理及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種采用GC-MS分析技術(shù)研究灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)代 謝組的樣品前處理方法及檢測方法，涉及微生物學和儀器分析【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類基因組測序工作完成，基因功能的研究成為熱點，各種"組學"相繼出現(xiàn)， 代謝組學繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后應運而生。與其它組學有所不同，代謝組 學是研究生物體系（細胞，組織或生物體）受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的變化的科 學，因此代謝組學作為中心法則信息流的下游產(chǎn)物，往往更好地反映了生物體內(nèi)動態(tài)的化 學變化過程。
[0003] 草莓灰霉病是目前草莓生產(chǎn)中的重要病害之一，它常常造成草莓采后和儲運過程 中大量的經(jīng)濟損失。引發(fā)草莓灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)為子囊菌 門葡萄孢屬，其腐生能力強，寄主范圍廣，能侵染包括茄科、葫蘆科、薔薇科、豆科、葡萄科等 中的200余種植物。病原菌主要以菌絲體在腐爛的植物殘體中或者以菌核在土壤中越冬； 翌年春季條件適宜時，越冬的菌絲體或菌核可以產(chǎn)生大量的分生孢子，可侵染植株葉片、花 萼、果實等，借助氣流、雨水、農(nóng)事操作等完成再侵染。病原菌在O-KTC的低溫條件下仍具有 侵染活性，所以在低溫高濕條件下常引起貯藏期果實的嚴重損失。
[0004] 對于灰葡萄孢菌菌絲樣品的代謝組學進行研究，建立一種高效、快速、重現(xiàn)性好的 代謝組樣品前處理及檢測方法，對于揭示灰葡萄孢菌生長發(fā)育密切相關(guān)的代謝信息，探索 病原菌侵染植物過程中的重要代謝物及代謝過程，以及基于病原與寄主互作的研究結(jié)果分 析和發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶標等方面具有重要的意義。但目前有關(guān)灰葡萄孢菌代謝組學的研究 國內(nèi)外鮮有報道，尤其是基于GC-MS的代謝組檢測，樣品前處理和檢測尚缺乏系統(tǒng)可靠的 方法。
[0005] 雖然有關(guān)醫(yī)學樣品、植物樣品和一些微生物樣品國內(nèi)外已有不少相關(guān)的代謝組分 析方法的報道，但是，每一類生物樣品的代謝組都要求建立有特殊針對性的前處理和檢測 方法，否則，獲得的檢測結(jié)果是不可靠的。關(guān)于灰葡萄孢菌的代謝組學研究，由于缺少相應 的GC-MS分析方法，對使用何種物質(zhì)作為內(nèi)標不清楚，嚴重影響著分析系統(tǒng)的誤差。筆者 發(fā)現(xiàn)，文獻報道中經(jīng)常被用到的核糖醇、肌醇、1，3_丙二醇等內(nèi)標物質(zhì)在灰霉菌絲代謝組中 均可被檢出，不能用作灰葡萄孢菌代謝組分析的內(nèi)標物質(zhì)。而同位素類內(nèi)標物質(zhì)通常價格 昂貴，需要尋找另外一種本底中不含有的物質(zhì)作為內(nèi)標來添加。此外，提取溶劑的選擇決定 了獲得的代謝物的數(shù)目和豐度，衍生化反應試劑的選擇和反應時間、溫度等條件則對最終 GC-MS的分析范圍和方法的重現(xiàn)性具有重要的影響作用。而關(guān)于灰葡萄孢菌的代謝組分析 中這些參數(shù)均有待于通過研究確定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于GC-MS研究灰葡萄孢菌代謝組的樣品前處理及檢 測方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于GC-MS研究灰葡萄孢菌代謝組菌絲 樣品的培養(yǎng)、收集、滅活和保存的方法。
[0008] 所述培養(yǎng)方法為：將灰葡萄孢菌的菌絲組織于PDA固體培養(yǎng)基上17°C?23°C培養(yǎng) (優(yōu)選20°C )，將培養(yǎng)2?4d(優(yōu)選3d)的灰葡萄孢菌落按同心圓外緣打取菌餅，接至鋪有 玻璃紙的PDA平板上，17°C?23°C (優(yōu)選20°C )培養(yǎng)2?4d(優(yōu)選3d)，得菌絲培養(yǎng)物；
[0009] 所述收集方法具有以下特征：用刮刀刮取玻璃紙上的菌絲培養(yǎng)物，去除接種的菌 餅，收集至離心管中；
[0010] 所述滅活處理為：將裝有菌絲的離心管置于液氮中速凍3?5min ;
[0011] 所述保存方法為：將按上述方法培養(yǎng)、收集、滅活的菌絲樣品用封口膜密封后，置 于超低溫冰箱保存（優(yōu)選-80°C )。
[0012] 本發(fā)明還同時提供了對通過上述方法獲得的灰葡萄孢菌菌絲樣品進行代謝組提 取、干燥和衍生化的方法。
[0013] 所述提取方法包括以下步驟：
[0014] 1)冷凍研磨破碎：滅活后的菌絲在液氮條件下研磨，或采用球磨儀研磨破碎處 理，得菌絲粉末；
[0015] 2)代謝組提?。悍Q取100. 0±0. 5mg的菌絲粉末，準確加入4mL溶解5 μ g/mL內(nèi)標 物質(zhì)的提取溶劑，采用渦旋振蕩Imin后，繼續(xù)超聲提取20min ;
[0016] 3)離心處理：將2)提取獲得的代謝組溶液在4000?12000rpm (優(yōu)選12000rpm) 下進行離心5?15min (優(yōu)選IOmin)，棄去沉淀，得代謝組提取液；
[0017] 所述的干燥方法為抽真空離心干燥，特點是準確移取0. 6mL上清液至0. 6mL離心 管中，45°C抽真空離心干燥4?8h，直至質(zhì)量恒定；
[0018] 所述的衍生化方法包括肟化（或腙化）和三甲基硅烷化兩步衍生化反應，步驟如 下：
[0019] 1)吸取100 μ L衍生化試劑1加入已離心干燥好的樣品管中，封口，超聲15min，渦 旋Imin溶解，稍微離心后30°C條件下肟化（或腙化）衍生化反應2h ;
[0020] 2)加入100 μ L的衍生化試劑2至樣品管中，封口，超聲20min，稍微離心，37°C條 件下硅烷化衍生反應4?IOh (優(yōu)選6h);
[0021] 3)衍生化獲得的樣品在轉(zhuǎn)速10000?15000r/min(優(yōu)選12000r/min)下離心 15min，吸取上清液至GC樣品玻璃管中，獲得用于GC-MS檢測的灰葡萄孢菌菌絲代謝組樣 品。
[0022] 所述提取方法步驟2)所述提取溶劑為：甲醇與水混合溶液，甲醇與水混合體積比 為 9. 5 : 0· 5 ?5 : 5,優(yōu)選 8 : 2 ;
[0023] 所述提取方法步驟2)所述內(nèi)標物質(zhì)為：水楊苷（D(_)-Salicin);
[0024] 所述的衍生化方法步驟1)所述衍生化試劑1為：甲氧基胺鹽酸鹽溶解于吡啶獲得 的溶液，濃度為10?40mg/mL，優(yōu)選20mg/mL ;
[0025] 所述的衍生化方法步驟2)所述衍生化試劑2為：三甲基氯硅烷、N，O-雙三甲硅基 乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲 基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的任意一種。
[0026] 此外，本發(fā)明還同時提供了一種利用上述前處理方法獲得的代謝組樣品進行檢測 法的方法，其特征是：
[0027] 選用 HP-5MS 毛細管柱（30mX0. 25_X0. 25m);進樣體積 1 μ L ;流速 lmL/min ;程 序升溫；離子源和傳輸線溫度分別為230°C和280°C ;氦氣為載氣，恒壓模式；質(zhì)譜EI電離 源電子能量70eV，全掃描掃描范圍m/z 20?650,頻率0. 2s/scan ;溶劑延遲時間5. 5min。
[0028] 為了實現(xiàn)對灰葡萄孢菌代謝組學的研究，本發(fā)明提供一種基于GC-MS研究灰葡萄 孢菌代謝組學的樣品前處理方法，包括樣品的培養(yǎng)、收集、滅活及保存等，并對影響代謝物 提取效果的四個因素（提取溶劑成分、提取劑用量）在多個水平上進行設計，從而找出了最 適的代謝物提取方法。同時提供了一種適用于灰葡萄孢菌絲代謝組氣質(zhì)分析的內(nèi)標物質(zhì)和 衍生化試劑組合，對影響檢測結(jié)果準確性的衍生化條件（衍生時間和衍生溫度）在多個水 平上進行設計，從而找出了最適的代謝物衍生方法。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0030] 1、在樣品前處理方面，所采用的灰葡萄孢菌菌絲培養(yǎng)和收集過程最大程度的扣除 了培養(yǎng)基質(zhì)的干擾；液氮滅活配合低溫有機溶劑提取確保了菌絲中相關(guān)酶系的滅活，保證 了菌絲樣品適時代謝組的獲得；所選內(nèi)標物可以降低灰葡萄孢菌絲代謝組GC-MS分析系統(tǒng) 的誤差；所用的衍生化方法可以檢測到氨基酸、糖類、酚類、有機酸、萜烯類等代謝物質(zhì)，最 大程度地提供代謝組的信息。
[0031] 2、在樣品檢測方面，進行了各種影響因素組合效果的檢測，得出了最適提取方法， 并進一步優(yōu)化了衍生條件，使色譜峰隨保留時間得到有效分離且峰形質(zhì)量好，可以達到目 標峰峰面積的準確積分的要求，實例驗證該方法操作快速簡單、提取效率高、重現(xiàn)性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0033] 圖1本發(fā)明工藝流程圖
[0034] 圖2不同提取溶劑對菌絲代物提取效果典型TIC圖
[0035] 圖3提取溶劑劑量對灰葡萄孢菌S28菌絲代謝組分析的影響
[0036] 圖4衍生化溫度和時間對灰葡萄孢菌S28菌絲代謝組分析的影響
[0037] 圖5灰葡萄孢菌S28菌絲代謝組GC-MS分析優(yōu)化方法的重現(xiàn)性
[0038] 圖6灰葡萄孢菌S28菌核代謝組典型TIC圖

【具體實施方式】
[0039] 實施例1基于GC-MS對灰葡萄孢菌S28代謝組進行檢測分析
[0040] 采用的工藝流程如圖1所示，具體實施如下：
[0041] 一、基于GC-MS研究灰葡萄孢菌S28代謝組的樣品前處理
[0042] 1)灰葡萄孢菌的培養(yǎng)
[0043] 取生長3d的灰葡萄孢菌S28的PDA培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺中，用0. 5cm打孔 器沿著菌落外沿打取菌餅，用挑針挑取菌餅并接到鋪有玻璃紙的固體PDA培養(yǎng)基平板上， 19. 5?20. 5°C條件下培養(yǎng)3d，得菌絲培養(yǎng)物；
[0044] 2)灰葡萄孢菌菌絲收集：用滅菌的刮刀刮取玻璃紙上生長的菌絲培養(yǎng)物，去除接 種的菌餅，收集于2mL離心管中。
[0045] 3)液氮滅活處理：將裝有菌絲的離心管迅速置于液氮中速凍3?5min。
[0046] 4)菌絲樣品保存：將按上述方法培養(yǎng)、收集、滅活的菌絲樣品用封口膜密封后，置 于-80°C冰箱保存。
[0047] 5)研磨破碎：取液氮滅活處理的菌絲樣品，采用球磨儀以30次/s的頻率研磨 2min進行破碎處理，得菌絲粉末。
[0048] 6)不同溶劑對代謝組提取效果比較
[0049] 按照表1-1分別配制溶劑極性強、中、弱三種代謝組提取溶劑I、II和III :
[0050] 表1-1代謝組提取溶劑組成
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 灰葡萄孢菌代謝組樣品前處理方法，包括以下方法并依次進行：菌絲的培養(yǎng)、收集、 滅活、保存、代謝組的提取、干燥和衍生化。
2. 權(quán)利要求1所述灰葡萄孢菌菌絲樣品的培養(yǎng)、收集、滅活和保存方法，其特征是： 所述培養(yǎng)方法為：將灰葡萄孢菌的菌絲組織于PDA固體培養(yǎng)基上17?23°C培養(yǎng)（優(yōu) 選20°C )，將培養(yǎng)2?4d (優(yōu)選3d)的灰葡萄孢菌落按同心圓外緣打取菌餅，接至鋪有玻璃 紙的PDA平板上，17?23°C (優(yōu)選20°C )培養(yǎng)2?4d (優(yōu)選3d)，得菌絲培養(yǎng)物； 所述收集方法具有以下特征：用刮刀刮取玻璃紙上的菌絲培養(yǎng)物，去除接種的菌柄，收 集至離心管中； 所述滅活處理為：將裝有菌絲的離心管置于液氮中速凍3?5min ; 所述保存方法為：將按上述方法培養(yǎng)、收集、滅活的菌絲樣品用封口膜密封后，置于超 低溫冰箱保存（優(yōu)選-80°C )。
3. 權(quán)利要求1所述灰葡萄孢菌菌絲代謝組的提取、干燥和衍生化方法，其特征是： 所述提取方法包括以下步驟： 1) 冷凍研磨破碎：滅活后的菌絲在液氮條件下研磨，或采用球磨儀研磨破碎處理，得 菌絲粉末； 2) 代謝組提?。悍Q取100. 0±0. 5mg的菌絲粉末，準確加入4mL溶解5 y g/mL內(nèi)標物質(zhì) 的提取溶劑，采用渦旋振蕩lmin后，繼續(xù)超聲提取20min 3) 離心處理：將2)提取獲得的代謝組溶液在4000?12000rpm (優(yōu)選12000rpm)下進 行離心5?15min (優(yōu)選lOmin)，棄去沉淀，得代謝組提取液； 所述的干燥方法為抽真空離心干燥，特點是準確移取〇. 6mL上清液至0. 6mL離心管中， 45°C抽真空離心干燥4?8h，直至質(zhì)量恒定； 所述的衍生化方法包括肟化（或腙化）和三甲基硅烷化兩步衍生化反應，步驟如下： 1) 吸取100 UL衍生化試劑1加入已離心干燥好的樣品管中，封口，超聲15min，渦旋 lmin溶解，稍微離心后30°C條件下肟化（或腙化）衍生化反應2h ; 2) 加入lOOii L的衍生化試劑2至樣品管中，封口，超聲20min，稍微離心，37°C條件下 娃燒化衍生反應4?10h (優(yōu)選6h); 3) 衍生化獲得的樣品在轉(zhuǎn)速10000?15000r/min(優(yōu)選12000r/min)下離心15min， 吸取上清液至GC樣品玻璃管中，獲得用于GC-MS檢測的灰葡萄孢菌菌絲代謝組樣品。
4. 權(quán)利要求3所述的提取溶劑、內(nèi)標物質(zhì)和衍生化反應所用的試劑組合： 所述提取溶劑為：甲醇與水混合溶液，甲醇與水混合體積比為9. 5 : 0. 5?5 : 5,優(yōu) 選8 : 2 ; 所述的內(nèi)標物質(zhì)為：水楊苷（D(-)-Salicin); 所述衍生化試劑1為：甲氧基胺鹽酸鹽溶解于吡啶獲得的溶液，濃度為10?40mg/mL， 優(yōu)選 20mg/mL ; 所述的衍生化試劑2為：三甲基氯硅烷、N，0-雙三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，0-雙 三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲 娃基乙酰胺中的任意一種。
5. 利用如權(quán)利要求1-4所述方法獲得樣品進行的檢測法，其特征是： 選用HP-5MS毛細管柱，程序升溫，離子源和傳輸線溫度分別為230°C和280°C，采用EI 電離源，全掃描范圍m/z20?650。
【文檔編號】G01N30/06GK104391060SQ201410543382
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】劉鵬飛, 胡志宏, 常旭念, 李蕾, 吳嘉純, 劉西莉, 陳晨, 侯燕華, 黃中喬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學