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腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法和腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒，所述腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法的特征在于，對(duì)生物體試樣中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23及25羥化維生素D進(jìn)行測(cè)定；所述腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒的特征在于，包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23測(cè)定試劑及25羥化維生素D測(cè)定試劑。通過(guò)本發(fā)明，能夠提供對(duì)于確定給藥的選定、更嚴(yán)密的飲食療法、早期透析導(dǎo)入等治療方針有用的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法及腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒。
【專利說(shuō)明】腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法及腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23 (以下稱為FGF-23)為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族中的一員，為主要由骨組織產(chǎn)生的251個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，其作用于腎臟從而抑制腎小管的磷的再吸收。近年來(lái)的研究啟示，低磷血癥性佝僂病、腫瘤骨質(zhì)軟化病、腎功能衰竭等疾病與FGF-23相關(guān)(參照非專利文獻(xiàn)I)。由此認(rèn)為測(cè)定血中的FGF-23對(duì)于監(jiān)測(cè)這些疾病的病理狀態(tài)是有用的，因此近年來(lái)成為倍受關(guān)注的標(biāo)記物(專利文獻(xiàn)I)。
[0003]25羥化維生素D (以下稱為25 (OH)D)是被吸收到體內(nèi)的維生素D在肝臟其側(cè)鏈的25位被羥化而成的。在體內(nèi)，進(jìn)一步在腎其I位或24位被羥化而代謝成I α，25- 二羥基維生素 D (Ια, 25 (OH) 2D)、24，25-二羥基維生素 D (24，25 (OH) 2D)。
[0004]維生素D本身幾乎不具有生理活性，而且由于代謝、向脂肪組織轉(zhuǎn)移等，血中濃度會(huì)發(fā)生較大變動(dòng)，因此通常不太對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。維生素D首先在肝臟被25-羥化酶快速代謝而在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?5 (OH) D，進(jìn)而在腎臟被I α -羥化酶將I α位羥化而代謝為活性型的I α，25- 二羥基維生素D。
[0005]活性型的I α，25- 二羥基維生素D促進(jìn)從小腸吸收鈣和磷，并且促進(jìn)骨鹽從骨中溶出。另外，還在腎臟促進(jìn)鈣和磷的再吸收，從而在維持生物體的鈣和磷的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。
[0006]維生素D不足會(huì)導(dǎo)致幼兒發(fā)生佝僂病、成人發(fā)生骨質(zhì)軟化病或骨質(zhì)疏松癥。由此認(rèn)為測(cè)定25 (OH) D對(duì)于監(jiān)測(cè)維生素D缺乏癥和不足癥的病理狀態(tài)是有用的(非專利文獻(xiàn)2)
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:W02003/057733小冊(cè)子
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)1:腎i骨代謝、第15卷、第4號(hào)、第351-356頁(yè)(2002).[0012]非專利文獻(xiàn)2:Kidney Int.Vol.55 (6), p.2169-2177 (1999).
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]發(fā)明要解決的課題
[0014]本發(fā)明的目的在于提供對(duì)于確定腎功能衰竭患者的治療方針有效的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法及預(yù)后判斷用試劑盒。
[0015]用于解決課題的手段
[0016]本
【發(fā)明者】們?yōu)榱私鉀Q上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果獲得了以下認(rèn)知，通過(guò)測(cè)定試樣中的FGF-23及25 (OH) D并將其測(cè)定值組合起來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，能夠判斷腎功能衰竭的預(yù)后，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的[I]~[6]。
[0017][I] 一種腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法，其特征在于，對(duì)生物體試樣中的FGF-23及25 (OH) D進(jìn)行測(cè)定。
[0018][2]根據(jù)[I]所述的方法，其中，F(xiàn)GF-23通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
[0019][3]根據(jù)[I]或[2]所述的方法，其中，25 (OH) D通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
[0020][4] 一種腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒，其特征在于，包含F(xiàn)GF-23測(cè)定試劑及25 (OH) D測(cè)定試劑。
[0021][5]根據(jù)[4]所述的試劑盒，其中，F(xiàn)GF-23測(cè)定試劑為含有與FGF-23結(jié)合的抗體的試劑。 [0022][6]根據(jù)[4]或[5]所述的試劑盒，其中，25 (OH) D測(cè)定試劑為含有與25 (OH)D結(jié)合的抗體的試劑。
[0023]發(fā)明效果
[0024]通過(guò)本發(fā)明，提供能夠選定腎功能衰竭患者中的預(yù)后不良群體、并對(duì)于確定給藥的選定、更嚴(yán)密的飲食療法、早期透析導(dǎo)入等治療方針有用的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法及預(yù)后判斷用試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為對(duì)使用了患者基本信息以及各種測(cè)定值的與腎事件(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)發(fā)病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)的多變量分析的分析圖。
[0026]圖2為對(duì)基于25(0H)D濃度的患者組(4個(gè)組)及基于FGF-23濃度的患者組(Ql~Q5這5個(gè)組)的各組的與腎事件(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)發(fā)病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)的多變量分析的分析圖。
[0027]圖3為表示25(0!00低值且？6?-23低值組((^組)、25(0!00高值且？6?-23低值組(Df組)、25 (OH)D低值且FGF-23高值組(dF組)、25 (OH)D高值且FGF-23高值組(DF組)這4組的約5年間的無(wú)腎事件(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)時(shí)的生存概率的Kaplan-Meier生存曲線。
[0028]圖4為在圖3的研究中進(jìn)一步用年齡、性別、糖尿病、心血管病疾患、高血壓、血紅蛋白、血清白蛋白、尿蛋白、推定腎小球?yàn)V過(guò)量(eGFR)、血清鈣、血清磷、骨化三醇(I，25- 二羥基維生素D3)、全長(zhǎng)1-84甲狀旁腺素(全長(zhǎng)PTH)、采血的季節(jié)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑(ARB)的給予、活性型維生素D給予、鈣給予進(jìn)行修正后的Kaplan-Meier 生存曲線。
[0029]圖5為利用25 (OH) D濃度與FGF-23濃度的組合對(duì)4組的與腎事件發(fā)病(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)的多變量分析的分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]<腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法>
[0031]本發(fā)明的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法的特征在于，對(duì)生物體試樣中的FGF-23及25 (OH) D進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法包含例如以下的工序。
[0032][ I ]對(duì)生物體試樣中的FGF-23進(jìn)行測(cè)定的工序；[0033][2]將通過(guò)工序[I]得到的測(cè)定值與預(yù)先作成的表示FGF-23濃度與測(cè)定值之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定生物體試樣中的FGF-23濃度的工序；
[0034][3]對(duì)生物體試樣中的25 (OH) D進(jìn)行測(cè)定的工序；
[0035][4]將通過(guò)工序[3]得到的測(cè)定值與預(yù)先作成的表示25 (OH) D濃度與測(cè)定值之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定生物體試樣中的25 (OH) D濃度的工序；
[0036][5]根據(jù)通過(guò)工序[2]確定的FGF-23濃度和通過(guò)工序[4]確定的25 (OH) D濃度，當(dāng)FGF-23濃度為以針對(duì)供于測(cè)定的全部生物體試樣的FGF-23濃度為基礎(chǔ)確定的中央值以上、且25 (OH)D濃度小于以針對(duì)供于測(cè)定的全部生物體試樣的25 (OH)D濃度為基礎(chǔ)確定的中央值時(shí)，判斷為腎功能衰竭的預(yù)后不良；當(dāng)FGF-23濃度小于FGF-23中央值、且25(OH) D濃度為25 (OH)D中央值以上時(shí)，判斷為腎功能衰竭的預(yù)后良好的工序。
[0037]在工序[5]中，當(dāng)以針對(duì)供于測(cè)定的全部生物體試樣的FGF-23濃度和25 (OH) D濃度為基礎(chǔ)確定的FGF-23濃度的中央值、25 (OH) D濃度的中央值例如分別為49.4pg/mL、23.0ng/mL時(shí)，可以將FGF-23濃度為49.4pg/mL以上且25 (OH) D濃度小于23.0ng/mL的受試者判斷為腎功能衰竭的預(yù)后不良，將FGF-23濃度小于49.4pg/mL且25 (OH) D濃度為23.0ng/mL以上的受試者判斷為腎功能衰竭的預(yù)后良好。
[0038]這里，F(xiàn)GF-23濃度的中央值是指當(dāng)將針對(duì)全部生物體試樣確定的FGF-23濃度從值較小的一側(cè)依次排列時(shí)正好位于正中的FGF-23的濃度。同樣地，25 (OH) D濃度的中央值是指當(dāng)將針對(duì)全部生物體試樣確定的25 (OH) D濃度從值較小的一側(cè)依次排列時(shí)正好位于正中的25 (OH)D的濃度。
[0039]關(guān)于本發(fā)明中的生物體試樣，只要是能夠測(cè)定FGF-23和25 (OH)D的試樣，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如全血、血清、血漿等，優(yōu)選血清或血漿。
[0040]作為FGF-23的測(cè)定方法，只要是能夠測(cè)定FGF-23的方法，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如使用與FGF-23結(jié)合的抗體來(lái)進(jìn)行測(cè)定的免疫學(xué)測(cè)定方法等。作為免疫學(xué)測(cè)定方法，只要是免疫測(cè)定法、免疫印跡法、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、溶血反應(yīng)、沉降反應(yīng)、金膠體法、色譜法、免疫染色法等利用了抗原抗體反應(yīng)的方法則包括所有的方法，但優(yōu)選可列舉出免疫測(cè)定法。
[0041]免疫測(cè)定法是使用進(jìn)行了各種標(biāo)記的抗原或抗體對(duì)抗體或抗原進(jìn)行檢測(cè)或定量的方法，根據(jù)抗原或抗體的標(biāo)記方法的不同，可列舉出放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶免疫測(cè)定法(EIA或ELISA)、化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法(CLEIA或CLIA)、熒光免疫測(cè)定法(FIA)、發(fā)光免疫測(cè)定法(luminescent immunoassay)、物理化學(xué)測(cè)定法(TIA、LAPIA、PCIA)、流式細(xì)胞法等，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法等。免疫測(cè)定法還可以是夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法。
[0042]使用免疫測(cè)定法測(cè)定生物體試樣中的FGF-23可以采用例如以下的方法進(jìn)行。
[0043][I]將生物體試樣中的FGF-23固定到載體上、且使其和與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及在與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段上鍵合有標(biāo)記的標(biāo)記化第2抗體反應(yīng)，從而在載體上形成由第I抗體、FGF-23、及標(biāo)記化第2抗體構(gòu)成的免疫復(fù)合物的工序；
[0044][2]對(duì)形成的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定的工序；以及、
[0045][3]將通過(guò)工序[2]得到的測(cè)定值與預(yù)先作成的表示FGF-23濃度與測(cè)定值之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，從而確定生物體試樣中的FGF-23濃度的工序。
[0046]上述工序[I]與工序[2]之間還可以插入洗滌工序。[0047]關(guān)于標(biāo)記，只要是能夠與抗FGF-23抗體結(jié)合并用于FGF-23的測(cè)定的標(biāo)記，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。
[0048]當(dāng)使用過(guò)氧化物酶作為標(biāo)記時(shí)，可以使用后述的標(biāo)記測(cè)定用試劑對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。即，可以通過(guò)對(duì)免疫復(fù)合物中的標(biāo)記(=過(guò)氧化物酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。
[0049]當(dāng)使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記時(shí)，可以使用后述的標(biāo)記測(cè)定用試劑對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。即，可以通過(guò)對(duì)免疫復(fù)合物中的標(biāo)記(=堿性磷酸酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。
[0050]當(dāng)使用β -半乳糖苷酶作為標(biāo)記時(shí)，可以使用后述的標(biāo)記測(cè)定用試劑對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。即，可以通過(guò)對(duì)免疫復(fù)合物中的標(biāo)記(=β_半乳糖苷酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。
[0051]當(dāng)使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記時(shí)，可以通過(guò)對(duì)來(lái)自免疫復(fù)合物中的標(biāo)記(=熒光物質(zhì))的熒光進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)FGF-23進(jìn)行測(cè)定。作為熒光物質(zhì)，可列舉出例如FITC (異硫氰酸突光素)、RITC (羅丹明B -異硫氰酸酯)、量子點(diǎn)(quantum dot)(Science, 281, 2016-2018，1998)、藻紅蛋白等藻膽蛋白(phycobili protein)、GFP (綠色突光蛋白)、RFP (紅色熒光蛋白)、YFP (黃色熒光蛋白)、BFP (藍(lán)色熒光蛋白)等。
[0052]當(dāng)使用發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記時(shí)，通過(guò)測(cè)定來(lái)自免疫復(fù)合物中的標(biāo)記(=發(fā)光物質(zhì))的發(fā)光，能夠?qū)GF-23進(jìn)行測(cè)定。作為發(fā)光物質(zhì)，可列舉出例如吖啶鎗及其衍生物、釕配位化合物、洛芬堿等。
[0053]另外，F(xiàn)GF-23的測(cè)定還可以使用市售的FGF-23測(cè)定試劑盒來(lái)進(jìn)行。作為市售的FGF-23測(cè)定試劑盒，可列舉出例如“FGF-23測(cè)定試劑”(KAIN0S公司制)等。
[0054]作為25 (OH)D的測(cè)定方法，只要是能夠測(cè)定25 (OH)D的方法，，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如使用抗25 (OH)D抗體進(jìn)行測(cè)定的免疫學(xué)測(cè)定方法等。作為免疫學(xué)測(cè)定方法，只要是免疫測(cè)定法、免疫印跡法、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、溶血反應(yīng)、沉降反應(yīng)、金膠體法、色譜法、免疫染色法等利用了抗原抗體反應(yīng)的方法，則所有方法均包含在內(nèi)。作為25 (OH)D測(cè)定方法，優(yōu)選可列舉出免疫測(cè)定法。
[0055]作為免疫測(cè)定法，可列舉出例如上文所述的測(cè)定法等。
[0056]使用免疫測(cè)定法測(cè)定生物體試樣中的25 (OH) D例如可以按照以下的方法進(jìn)行。
[0057][I]將生物體試樣中的25 (OH) D固定的載體上、且使其和與25 (OH) D結(jié)合的第I抗體或其片段、以及在與25 (OH) D結(jié)合的第2抗體或其片段上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化第2抗體反應(yīng)，從而在載體上形成由第I抗體、25 (OH) D及標(biāo)記化第2抗體構(gòu)成的免疫復(fù)合物的工序；
[0058][2]對(duì)形成的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定的工序；以及，
[0059][3]將通過(guò)工序[2]得到的測(cè)定值與預(yù)先作成的表示25 (OH) D濃度與測(cè)定值之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，從而確定生物體試樣中的25 (OH)D濃度的工序。
[0060]上述工序[I]與工序[2]之間還可以插入洗滌工序。
[0061]關(guān)于標(biāo)記，只要是能夠與抗25 (OH)D抗體結(jié)合并能夠測(cè)定25 (OH)D的標(biāo)記，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的標(biāo)記等。另外，25(0H)D的測(cè)定還可以使用市售的25(OH)D測(cè)定試劑盒來(lái)進(jìn)行。作為市售的25 (OH)D測(cè)定試劑盒，可列舉出例如“LIAIS0N250HVitamin D TOTAL Assay” (DiaSorin 公司制)、“25_0H Vitamin D, Direct ELISA Kit”(Immundiagnostik 公司制)等。
[0062]<腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒>
[0063]本發(fā)明的腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒是用于本發(fā)明的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法的試劑盒，其包含F(xiàn)GF-23測(cè)定試劑及25 (OH) D測(cè)定試劑。本發(fā)明的試劑盒中還可以進(jìn)一步包含生物體試樣的稀釋液、反應(yīng)緩沖液、洗滌液、標(biāo)記物的檢測(cè)用試劑等。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以與適于測(cè)定的機(jī)器組合構(gòu)成試劑盒。
[0064](l)FGF-23 測(cè)定試劑
[0065]作為FGF-23測(cè)定試劑，只要是能夠測(cè)定生物體試樣中的FGF-23的試劑，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如(I)固定在載體上、且含有與FGF-23結(jié)合的第I抗體及在與FGF-23結(jié)合的第2抗體上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化第2抗體的試劑、(2)固定在載體上、且含有與FGF-23結(jié)合的抗體及在與FGF-23競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的試劑、(3)固定在載體上、且含有與FGF-23競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)及在與FGF-23結(jié)合的抗體上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化抗體的試劑等。此外，F(xiàn)GF-23測(cè)定試劑中根據(jù)需要還可以含有生物體試樣的稀釋液、反應(yīng)緩沖液、洗滌液、標(biāo)記檢測(cè)用試劑、FGF-23的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等。
[0066]作為與FGF-23結(jié)合的抗體(抗FGF-23抗體)，只要是與FGF-23結(jié)合的抗體，則沒(méi)有特殊限制，可列舉出例如羊、兔、大鼠、小鼠等的抗FGF-23抗體等。抗FGF-23抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。另外，還可以使用抗FGF-23抗體的片段。作為抗體片段，可列舉出例如將抗體用木瓜蛋白酶處理而得到的Fab、通過(guò)胃蛋白酶處理而得到的F (ab’ )
2、通過(guò)胃蛋白酶處理-還原處理而得到的除去了 Fab’等的Fe部分的抗體片段等。當(dāng)使用第I抗體和第2抗體時(shí)，第I抗體的抗原識(shí)別部位與第2抗體的抗原識(shí)別部位可以相同，也可以不同，優(yōu)選不同。
[0067]作為與FGF-23競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，只要是能夠與FGF-23競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如FGF-23自身、含有相當(dāng)于抗FGF-23抗體的抗原識(shí)別部位的肽的物質(zhì)等。
[0068]作為載體，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的載體，則沒(méi)有特別限制，可列舉出平板、乳膠、磁性粒子等。作為抗FGF-23抗體及競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)在載體上的固定，可列舉出例如物理方法、化學(xué)方法等。作為物理方法，可列舉出例如利用物理吸附的方法等。作為化學(xué)方法，可列舉出例如利用抗生物素蛋白-生物素的相互作用的方法、利用接頭的方法等。
[0069]作為生物體試樣的稀釋液，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的稀釋液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如在水性介質(zhì)中含有表面活性劑、蛋白等的水溶液等。作為水性介質(zhì)，可列舉出例如脫離子水、蒸餾水、緩沖液等。作為緩沖液，可列舉出例如磷酸緩沖液、Good’ s緩沖液等。作為Good’s緩沖液，可列舉出例如2-嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖液、雙(2-羥基乙基)亞氨基三(羥基甲基)甲烷(Bis-Tris)緩沖液、三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖液、N- (2-乙酰胺)亞氨基二乙酸(ADA)緩沖液、哌嗪-N，N’ -雙(2-乙磺酸)(PIPES)緩沖液、2- [N- (2-乙酰胺)氨基]乙磺酸(ACES)緩沖液、3-嗎啉代-2-羥基丙磺酸(M0PS0)緩沖液、2- [N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]乙磺酸(BES)緩沖液、3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)緩沖液、2- {N-[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)緩沖液、N- (2-羥基乙基)-N’ - (2-磺基乙基)哌嗪(HEPES)緩沖液、3- [N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]_2_羥基丙磺酸(DIPSO)緩沖液、2-羥基-3- {[N-三(羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPSO)緩沖液、哌嗪-N，N’ -雙(2-羥基丙烷-3-磺酸)(POPSO)緩沖液、N- (2-羥基乙基)-N’ - (2-羥基-3-磺基丙基)哌嗪(HEPPSO)緩沖液、N- (2-羥基乙基)-N’ - (3-磺基丙基)哌嗪(EPPS)緩沖液、[N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸](Tricine)緩沖液、[N，N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸](Bicine)緩沖液、3- [N-三(羥基甲基)甲基]氨基丙磺酸(TAPS)緩沖液、2- (N-環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)緩沖液、3- (N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(CAPSO)緩沖液、3- (N-環(huán)己基氨基)丙磺酸(CAPS)緩沖液等。
[0070]作為表面活性劑，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的表面活性劑，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如非離子性表面活性劑、陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、兩性表面活性劑等。作為蛋白，可列舉出例如牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)、酪蛋白、BlockAce (大日本制藥公司制)等。
[0071]作為反應(yīng)緩沖液，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的緩沖液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的緩沖液等。反應(yīng)緩沖液中根據(jù)需要還可以含有表面活性劑、蛋白、金屬離子、糖類、防腐劑等。作為表面活性劑，可列舉出例如上文所述的表面活性劑等。作為蛋白，可列舉出例如上文所述的蛋白等。作為金屬離子，可列舉出例如鎂離子、錳離子、鋅離子等。作為糖類，可列舉出例如甘露醇、山梨糖醇等。作為防腐劑，可列舉出例如疊氮鈉、抗生素(鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、BioAce等。
[0072]作為洗滌液，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的洗滌液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如磷酸緩沖化生理鹽水(含有0.15mol/L氯化鈉的10mmol/L磷酸緩沖液、pH為7.2)(PBS)等。洗滌液中根據(jù)需要還可以含有上文所述的表面活性劑、蛋白、防腐劑等。
[0073]標(biāo)記測(cè)定用試劑是用于對(duì)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)生成的免疫復(fù)合物中的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定的試劑，只要是能夠用于測(cè)定FGF-23的標(biāo)記測(cè)定用試劑，則沒(méi)有特殊限制。關(guān)于標(biāo)記，只要是與抗FGF-23抗體結(jié)合且能夠用于測(cè)定FGF-23的標(biāo)記，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶等。標(biāo)記測(cè)定用試劑中根據(jù)需要還可以含有上文所述的表面活性劑、蛋白、金屬離子、糖類、防腐劑等。
[0074]當(dāng)使用過(guò)氧化物酶作為標(biāo)記時(shí)，作為標(biāo)記測(cè)定用試劑，可列舉出例如含有過(guò)氧化氫和熒光底物的試劑、含有過(guò)氧化氫和發(fā)光底物的試劑等。通過(guò)對(duì)標(biāo)記(=過(guò)氧化物酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，能夠?qū)GF-23進(jìn)行測(cè)定。作為熒光底物，可列舉出例如4-羥基苯基乙酸、3- (4-羥基苯基)丙酸、香豆素等。作為發(fā)光底物，可列舉出例如魯米諾(Iuminol)化合物、光澤精(Iucigenin)化合物等。
[0075]當(dāng)使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記時(shí)，作為標(biāo)記測(cè)定用試劑，可列舉出例如含有堿性磷酸酶的底物的試劑等。通過(guò)對(duì)標(biāo)記(=堿性磷酸酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，能夠?qū)GF-23進(jìn)行測(cè)定。作為堿性磷酸酶的底物，可列舉出例如3_ (2’-螺旋金剛燒)_4_甲氧基_4_ (3’-憐酸氧基)苯基-1, 2_ 二氧雜環(huán)丁燒二納鹽(AMPPD)>2-氣-5_ { 4-甲氧基螺[I，2- 二氧雜環(huán)丁燒 _3，2' - (5'-氣)二環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]_4-基}苯基磷酸二鈉鹽(CDP-Star?)、3- {4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2’ - (5，-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸二鈉鹽(CSPD?)、[ 10-甲基-9 (10 H)-acridinylidene]苯氧基甲基憐酸二納鹽(Lumigen? APS_5)、9_ (4-氣苯基硫代磷酰氧基亞甲基)-10-甲基吖啶酮二鈉鹽等。
[0076]當(dāng)使用β_半乳糖苷酶作為標(biāo)記時(shí)，作為標(biāo)記測(cè)定用試劑，可列舉出例如含有β-半乳糖苷酶的底物的試劑等。通過(guò)對(duì)標(biāo)記(=β-半乳糖苷酶)與標(biāo)記測(cè)定用試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定，能夠?qū)GF-23進(jìn)行測(cè)定。作為β_半乳糖苷酶的底物，可列舉出例如4_甲基傘花基-D-半乳糖昔、Galacton-Plus [Applied Biosystems公司制]或它的類似化合物等。
[0077]作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可列舉出通過(guò)基因重組技術(shù)獲得的、或者從生物體試樣獲得的FGF-23或表達(dá)有FGF-23的細(xì)胞等。
[0078](2)25 (OH) D 測(cè)定試劑
[0079]作為25 (OH)D測(cè)定試劑，只要是能夠用于測(cè)定生物體試樣中的25 (OH)D的試劑，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如(I)固定在載體上、且含有與25 (OH)D結(jié)合的第I抗體及在與25 (OH) D結(jié)合的第2抗體結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化第2抗體的試劑、(2)固定在載體上、且含有與25 (OH) D結(jié)合的抗體及在與25 (OH) D競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)的試劑、(3)固定在載體上、且含有與25 (OH) D競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)及在與25 (OH)D結(jié)合的抗體結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化抗體的試劑等。此外,25 (OH) D測(cè)定試劑中根據(jù)需要還可以含有生物體試樣的稀釋液、反應(yīng)緩沖液、洗滌液、標(biāo)記檢測(cè)用試劑、25 (OH)D的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等。
[0080]作為與25 (OH) D結(jié)合的抗體(抗25 (OH) D抗體)，只要是與25 (OH) D結(jié)合的抗體，則沒(méi)有特殊限制，可列舉出例如羊、兔、大鼠、小鼠等的抗25 (OH)D抗體等?？?5 (OH)D抗體可以是多克隆抗體,也可以是單克隆抗體。另外,還可以使用抗25 (OH) D抗體的片段。作為抗體片段，可列舉出例如上文所述的片段等。當(dāng)使用第I抗體和第2抗體時(shí)，第I抗體的抗原識(shí)別部位與第2抗體的抗原識(shí)別部位可以相同，也可以不同，優(yōu)選不同。
[0081]作為與25 (OH) D競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，只要是能夠與25 (OH) D競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如25 (OH)D自身、或含有相當(dāng)于抗25 (OH) D抗體的抗原識(shí)別部位的25 (OH) D分子中的部分結(jié)構(gòu)的物質(zhì)等。
[0082]作為載體，只要是能夠用于測(cè)定25 (OH)D的載體，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的載體等。關(guān)于抗25 (OH)D抗體和競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)在載體上的固定，可列舉出例如上文所述的固定化方法等。
[0083]作為生物體試樣的稀釋液，只要是能夠用于測(cè)定25 (OH) D的稀釋液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的稀釋液等。
[0084]作為反應(yīng)緩沖液，只要是能夠用于測(cè)定25 (OH)D的緩沖液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的緩沖液等。反應(yīng)緩沖液中根據(jù)需要還可以含有上文所述的表面活性齊U、蛋白、金屬離子、糖類、防腐劑等。
[0085]作為洗滌液，只要是能夠用于測(cè)定25 (OH)D的洗滌液，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的洗滌液等。
[0086]作為標(biāo)記測(cè)定用試劑，只要是能夠用于測(cè)定25 (OH) D的標(biāo)記測(cè)定用試劑，則沒(méi)有特殊限制。關(guān)于標(biāo)記，只要是能夠與抗25 (OH) D抗體結(jié)合且用于測(cè)定25 (OH)D的標(biāo)記，則沒(méi)有特別限制，可列舉出例如上文所述的標(biāo)記等。作為標(biāo)記測(cè)定用試劑，可列舉出例如上文所述的標(biāo)記測(cè)定用試劑等。標(biāo)記測(cè)定用試劑中根據(jù)需要還可以含有上文所述的表面活性齊U、蛋白、金屬離子、糖類、防腐劑等。
[0087]作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可列舉出從生物體試樣制備的25 (OH) D或化學(xué)合成的25 (OH)D等。也可以使用市售的25 (OH) D作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0088]以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明，但這些實(shí)施例并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限定。
[0089]實(shí)施例1
[0090]<患者背景>
[0091]從患有慢性腎病的注冊(cè)進(jìn)行大阪維生素D研究的患者中選擇穩(wěn)定期的慢性腎病患者738名，并獲得了有關(guān)本研究的知情同意。大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬病院的倫理委員會(huì)認(rèn)可了本研究。從2005年5月至2007年7月進(jìn)行患者注冊(cè)，至2010年7月對(duì)經(jīng)過(guò)實(shí)施觀察。
[0092]<樣品測(cè)定>
[0093]在患者注冊(cè)時(shí)對(duì)包括全血、血清或血漿在內(nèi)的血液樣品和尿樣品進(jìn)行采樣，在30分鐘內(nèi)對(duì)血液樣品進(jìn)行離心分離，將得到的血清在一 80°C下冷凍保存直至測(cè)定。測(cè)定各種樣品中的肌酐、白蛋白、鈣和無(wú)機(jī)磷并算出eGFR。eGFR按照基于菊糖清除率的日本的標(biāo)準(zhǔn)方法估算。
[0094]全長(zhǎng)1-84PTH測(cè)定使用了 Scantibodies公司制的全長(zhǎng)PTH分析試劑盒。FGF-23的測(cè)定使用了 KAINOS公司制的試劑盒。骨化三醇的測(cè)定使用了 Immunodiagnostic Systems公司制的 TFBl, 25-hydroxyvitamin D RIA kit。另外，25 (OH) D 的測(cè)定使用了 DiaSorin公司制的125I RIA kit。各測(cè)定按照各公司所附文件中記載的條件和方法實(shí)施。
[0095](I)多變量分析中的腎事件(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)的風(fēng)險(xiǎn)比(Hazardratios)及95%置信區(qū)間的研究
[0096]使用患者基本信息以及各種測(cè)定值對(duì)腎事件發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行多變量分析。其結(jié)果示于圖1。圖1為表示各種危險(xiǎn)因子與風(fēng)險(xiǎn)比之間的關(guān)系的圖，各種危險(xiǎn)因子的3個(gè)數(shù)值從左依次表示風(fēng)險(xiǎn)比、95%置信區(qū)間的下限、95%置信區(qū)間的上限。這里，風(fēng)險(xiǎn)比是表示當(dāng)將無(wú)尿蛋白的組[尿蛋白(_)]作為對(duì)照組時(shí)、特定危險(xiǎn)因子的組的腎事件發(fā)生高了幾倍的值。另外，95%置信區(qū)間是以95%的概率計(jì)包含人群平均在內(nèi)的范圍。
[0097]從圖1可清楚地確認(rèn)，隨著25 (OH) D[25D]達(dá)到10ng/mL高濃度[2? (IOng/mL)]、隨著年齡增加10歲[年齡(10歲)]，女性[性別(女性)]、血紅蛋白高值(血紅蛋白)、eGFR為高值[eGFR (lOmL/min/1.73m2)]的情況下，有腎病進(jìn)展緩慢的傾向；另外確認(rèn)了:在FGF-23為高值(LogFGF-23)、心血管病疾患(現(xiàn)有CVD)、高血壓(收縮壓)及尿蛋白為3+以上[尿蛋白3(3+)]的情況下，有早期腎病進(jìn)展的傾向。
[0098](2)25 (OH) D及FGF-23的各組的腎事件的風(fēng)險(xiǎn)比及95%置信區(qū)間的研究
[0099]將25 (OH)D [25D]濃度分為小于 I Ong/mL、I Ong/mL 以上且小于 20ng/mL、20ng/mL以上且小于30ng/mL、30ng/mL以上這4組。另外，關(guān)于FGF-23 [FGF23]濃度，基于31.7?80.5pg/mL的濃度范圍，將FGF-23從低濃度至高濃度依次分為Ql?Q5這5組，分別研究了風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及95%置信區(qū)間(95%C.1.)。其結(jié)果示于圖2。圖2為表示各種危險(xiǎn)因子與風(fēng)險(xiǎn)比之間的關(guān)系的圖，各種危險(xiǎn)因子的括弧內(nèi)的3個(gè)數(shù)值從左起表示風(fēng)險(xiǎn)比、95%置信區(qū)間的下限、95%置信區(qū)間的上限。
[0100]關(guān)于25 (OH)D [25D]濃度，顯示越是從高濃度向低濃度轉(zhuǎn)移、腎事件的風(fēng)險(xiǎn)比越上升的傾向，即在最低的組(小于10ng/mL)中為最高的風(fēng)險(xiǎn)比(HR為11.5)。
[0101]關(guān)于FGF-23[FGF23]濃度，可見(jiàn)向著高濃度組一側(cè)、腎事件的風(fēng)險(xiǎn)比增加的傾向，對(duì)于Q2組、Q3組、Q4組、Q5組，顯示FGF-23濃度越高的組、風(fēng)險(xiǎn)比越高。
[0102](3)25 (OH) D及FGF-23的各組合組的腎事件的Kaplan-Meier生存曲線的研究
[0103]全部對(duì)象的25(0H)D濃度的中央值為23.0ng/mL、FGF_23濃度的中央值為49.4pg/mL,因此將25 (OH) D濃度小于23.0ng/mL的作為低值組、將23.0ng/mL以上的作為高值組。另外，將FGF-23濃度小于49.4pg/mL的作為低值組、將49.4pg/mL以上的作為高值組，將各組合分類為25 (OH) D濃度低值且FGF-23濃度低值組(df組)、25 (OH) D濃度高值且FGF-23濃度低值組(Df組)、25 (OH)D濃度低值且FGF-23濃度高值組(dF組)、25 (OH)D濃度高值且FGF-23濃度高值組(DF組)這4組，制成約5年間中的腎事件(血清肌酐倍增或透析導(dǎo)入)的Kaplan-Meier生存曲線。這里的Kaplan-Meier生存曲線是表示4組的各組在未發(fā)生腎事件的情況下生存概率與天數(shù)之間的關(guān)系的曲線。
[0104]將基于用年齡、性別、糖尿病、心血管病疾患、高血壓、血紅蛋白、血清白蛋白、尿蛋白、eGFR、血清鈣、血清磷、骨化三醇、全長(zhǎng)PTH、采血的季節(jié)、ACE抑制劑/ ARB的給予、活性型維生素D給予、鈣給予進(jìn)行修正前的數(shù)據(jù)的Kaplan-Meier生存曲線示于圖3，將基于修正后的數(shù)據(jù)的Kaplan-Meier生存曲線示于圖4。
[0105]從圖3及圖4可清楚地確認(rèn)，在修正前及修正后的任一數(shù)據(jù)中，25 (OH)D低值且FGF-23高值組(dF組)的腎事件發(fā)病顯著性地多。
[0106](4) 25 (OH) D與FGF-23的各組合組的腎事件的風(fēng)險(xiǎn)比及95%置信區(qū)間的研究
[0107]研究前項(xiàng)的25 (OH)D [25D]與FGF-23 [FGF23]的4個(gè)組合組的腎事件的風(fēng)險(xiǎn)比及95%置信區(qū)間。其結(jié)果示于圖5。
[0108]如圖5所示地確認(rèn)了，以25 (OH) D濃度高值且FGF-23濃度低值組(Df組)為基準(zhǔn)，25 (OH)D濃度低值且FGF-23濃度低值組(df組)的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和95%置信區(qū)間(95%C.1.)分別為1.47、0.63?3.43、25 (OH)D濃度高值且FGF-23濃度高值組(DF組)的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和 95% 置信區(qū)間(95%C.1.)分別為 1.96,0.88 ?4.36,25 (OH) D 濃度低值且 FGF-23濃度高值組(dF組)的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和95%置信區(qū)間(95%C.1.)分別為2.53,1.14?5.64。因此確認(rèn)了，25 (OH) D濃度低值且FGF-23濃度高值組(dF組)的腎事件的風(fēng)險(xiǎn)最高。
[0109]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0110]通過(guò)本發(fā)明，能夠提供對(duì)于確定腎功能衰竭患者的治療方針有用的腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法及腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒。
【權(quán)利要求】
1.一種腎功能衰竭的預(yù)后判斷方法，其特征在于，對(duì)生物體試樣中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23及25羥化維生素D進(jìn)行測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，25羥化維生素D通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
4.一種腎功能衰竭的預(yù)后判斷用試劑盒，其特征在于，包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23測(cè)定試劑及25羥化維生素D測(cè)定試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23測(cè)定試劑為含有與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23結(jié)合的抗體的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其中，25羥化維生素D測(cè)定試劑為含有與25羥化維生素D結(jié)合的抗體的試劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103608676SQ201280028543
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月25日
【發(fā)明者】濱野高行, 豬阪善隆, 松井功 申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社