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切片用固定液的配置方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種切片用固定液的配置方法及其應用，屬于臨床學應用【技術領域】。其由甲醇、戊二醛、乙醚混合，用PBS緩沖液稀釋；在上述溶液中溶液添加蔗糖充分混合調(diào)整pH值制備得到。通過前處理、蔗糖放置、包埋、切片和洗滌處理組織。本發(fā)明工作進程和步驟簡單，技術人員的操作工作量減少，整個過程操作步驟少，所需時間縮短，未經(jīng)脫水和浸蠟的組織能保持更高的新鮮度，針對免疫組化的抗原保持完整和優(yōu)秀，能提供更為正確的診斷條件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒試劑，減輕環(huán)境污染，增強對技術人員的身體健康的保障。
【專利說明】切片用固定液的配置方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種切片用固定液的配置方法及其應用，屬于臨床學應用【技術領域】?！颈尘凹夹g】
[0002]病理組織學檢查已經(jīng)在醫(yī)學史上有了一百多年的使用歷史，通過病理組織切片檢查，對于許多病情，尤其是腫瘤等病的病情得以最終的確定診斷。但是隨著醫(yī)學的發(fā)展，在常規(guī)腫瘤病理診斷中，有很多的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。
[0003]近年來，隨著臨床腫瘤的診斷和治療技術的發(fā)展，也隨著免疫組織化學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤通過特殊的免疫組化就得到了更為明確的診斷。特別是某些疑難的腫瘤，如果不通過免疫組化技術就不能獲得正確診斷，或形成嚴重的誤診。因此免疫組化尤其在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認識和重視，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，準確率可達65%-85%甚至以上。
[0004]免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面:
(O惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；
(2)確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；
(3)對某類腫瘤進行進一步的病理分型；
(4)軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；
(5 )發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床治療方案的確定,包括手術范圍的確定。
[0005](6)為臨床提供治療方案的選擇。
[0006]免疫組化在以前通常通過在石蠟切片或直接的冰凍切片上進行，但由于石蠟切片要通過脫水和脫蠟的相關過程處理，在這一系列的處理過程中組織中抗原原性損失較大，有些有效的抗原原性甚至全部消失，雖經(jīng)過一些抗原修復的技術方法，但還是難以達到處理以前的水平，這樣使得石蠟切片免疫組化診斷存在巨大缺陷，其診斷結(jié)果常常不能正確體現(xiàn)病情，甚至有時形成誤導。而常規(guī)直接的冰凍切片，由于冷凍時組織內(nèi)含水分快速膨脹，形成的冰晶撐破細胞膜等生物膜性結(jié)構(gòu)，使得切片難以保持良好的形態(tài)，如此情況也會使得診斷的定位失去意義，甚至出現(xiàn)假陽性的可能。
[0007]本發(fā)明所切出的組織切片既能保證形態(tài)的完整性，基本上能夠達到與石蠟切片同等的效果，同時又保證抗原性的基本不丟失。
[0008]與石蠟切片比較，還能體現(xiàn)出技術簡單，整個操作的步驟少，工作量降低。
[0009]無乙醇，二甲苯等毒性較大的溶液使用，改善技術操作人員的工作環(huán)境，也無周圍空氣污染等特出的優(yōu)點。
[0010]有關這種切片新技術和材料，以及在免疫組化上的實際應用，在江蘇省人民醫(yī)院的臨床病理實驗室進行過試用，并得以證實。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，提供一種切片用固定液的配置方法及其應用，其時間短，步驟簡單，工作量減少，無毒性試劑污染等優(yōu)點。
[0012]按照本發(fā)明提供的技術方案，是一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計步驟如下:甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至
8.0-9.3 ο
[0013]所述切片用固定液的應用，具體步驟如下:
(1)前處理:組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個組織標本；組織標本為l*lcm大小，1-2mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置l_24h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機直接切片，并直接在冰凍切片機上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%-0.10%，pH為7.4-8.6的標準磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進行染色或免疫組化試驗。
[0014]所述固定液的成分中:甲醇和戊二醛增強固定效果，乙醚加強滲透和穿透性，蔗糖增強組織透明度，PBS緩沖液保持溶液的酸堿度穩(wěn)定，氫氧化鈉和鹽調(diào)配酸堿度。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明使用這種固定液就能將待檢的病理組織不經(jīng)脫水浸蠟，直接在水溶解的條件下進行冰凍病理組織切片。這比較傳統(tǒng)的石蠟切片方法有如下優(yōu)點:工作進程和步驟簡單，技術人員的操作工作量減少，整個過程操作步驟少，所需時間縮短，未經(jīng)脫水和浸蠟的組織能保持更高的新鮮度，針對免疫組化的抗原保持完整和優(yōu)秀，能提供更為正確的診斷條件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒試劑，減輕環(huán)境污染，增強對技術人員的身體健康的保障。
【具體實施方式】
[0016]實施例1，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計步驟如下:
甲醇10份，戊二醛10份，乙醚5份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至8.0。
[0017]實施例2，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計步驟如下:
甲醇20份，戊二醛25份，乙醚15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖500g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至9.3。
[0018]實施例3，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計步驟如下:
甲醇15份，戊二醛20份，乙醚10份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖400g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至9。[0019]應用實施例1，所述切片用固定液的應用，具體步驟如下:
(1)前處理:對肺癌腫瘤組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個組織標本；組織標本為l*lcm大小，Imm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%的蔗糖水溶液中放置Ih ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置12h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機直接切片，并直接在冰凍切片機上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.10%,pH為7.4的標準磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進行染色或免疫組化試驗。
[0020]使用本固定液的新方法，可以通過具有不同抗體針對性的免疫組化技術，對各種肺癌的組織分型和腫瘤來源進行鑒定和區(qū)分。例如:非小細胞肺癌的來源是支氣管上皮的鱗狀上皮細胞，為鱗狀上皮癌的組織分型。小細胞肺癌來自于淋巴細胞相關抗原的陽性反應，為淋巴瘤來源的惡性腫瘤類型。肺泡腺癌的來源在于腺上皮細胞和粘液性細胞，為腺上皮或粘液腺癌的類型細胞。有一種惡性程度比較高的“燕麥”樣細胞肺癌，通過免疫組化可以發(fā)現(xiàn)是體現(xiàn)出一種惡黑樣細胞的抗原陽性，可以確定來源于皮膚上的惡性黑色素細胞瘤的轉(zhuǎn)移或誘發(fā)。有些肺部腫瘤細胞呈現(xiàn)間皮瘤抗原表現(xiàn)，這是典型的結(jié)締組織來源的間質(zhì)腫瘤。某些邊緣型肺癌呈現(xiàn)纖維細胞的抗原表型，可以確定為來自肺包膜，即胸膜腫瘤的情況。
[0021]各種肺癌發(fā)生來源確定對病情的判斷和預后，以及今后的治療方案確定具有重大的關聯(lián)，而明確的肺癌類型診斷也是目前胸腔外科臨床病理的一個重大難題。而本發(fā)明所述應用和免疫診斷技術也就是為肺癌診斷進行了一些巨大的改進，對肺癌的臨床診斷和治療具有很大的推進作用，對肺癌的臨床診斷和治療現(xiàn)狀具有很大的實際意義。
[0022]應用實施例2，所述切片使用的固定液的應用，具體步驟如下:
(1)前處理:對乳房癌腫瘤組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個組織標本；組織標本為l*lcm大小，2mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為40%的蔗糖水溶液中放置5h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置IOh；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機直接切片，并直接在冰凍切片機上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%%，pH為8的標準磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進行染色或免疫組化試驗。
[0023]乳房癌的診斷也涉及到很多的免疫組化問題。主要的是三種抗原，雌激素受體，孕激素受體，以及HER2抗原。前兩者一般抗原性強，在石蠟切片上就進行了廣泛使用。但是還是存在著很多的假陽性和假陰性。后者則抗原反應不是很強，一般情況下目前臨床只是作為診斷的參考指標。使用本發(fā)明所述應用和免疫組化診斷后，雌激素受體和孕激素受體的反應可以進一步增強和提高，免疫組化的水平可以說基本上能夠杜絕假陽性和假陰性的干擾。而HER2的免疫組化，就能將原來不可確定的水平標準提高到基本能夠確定做診斷的標準。這個抗原其實對乳房癌的發(fā)生發(fā)展和組織來源的確定其科學意義很大，只是以前不能充分地檢測確定，所以其意義沒有更多地被認識到和運用到。[0024]應用實施例3，所述切片使用的固定液的應用，具體步驟如下:
(1)前處理:對淋巴組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個組織標本；組織標本為l*lcm大小，1.5mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為40%的蔗糖水溶液中放置12h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置24h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機直接切片，并直接在冰凍切片機上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.8%，pH為8的標準磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進行染色或免疫組化試驗。
[0025]對淋巴瘤和白血病的認識。由于人體血液內(nèi)各種功能性的細胞很多，不同的類型細胞都有其不同的功能，也攜帶多種細胞的不同抗原。即便到形成造血免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，也會形成對不同類型細胞來源的腫瘤需要進行鑒別的要求。但是以前對于淋巴瘤和白血病腫瘤細胞的細胞學鑒別診斷技術上一直存在技術手段的缺陷，使得對是否是淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，以及是那種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，很多在具體針對性的病理細胞學診斷上不能正確地確定。這實際上也影響了這些腫瘤的正確治療。
[0026]使用本發(fā)明所述應用，能夠?qū)κ欠袷橇馨驮煅到y(tǒng)惡性腫瘤，是哪個類型的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，可以說有一個診斷上的明確的鑒別和鑒定。這對今后對這類疾病的診斷和治療能起到很直接和巨大的幫助作用，而且對今后新型的治療腫瘤的特效性藥物的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)，以及今后的臨床實際使用，都可以說是意義非凡。
【權利要求】
1.一種切片用固定液的配置方法，其特征是配方比例按重量份計步驟如下: 甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至8.0-9.3。
2.權利要求1所述切片用固定液的應用，其特征是具體步驟如下: (1)前處理:組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個組織標本；組織標本為l*lcm大小，1-2mm厚； (2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ； (3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置l_24h； (4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機直接切片，并直接在冰凍切片機上沾片； (5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%-0.10%，pH為7.4-8.6的標準磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進行染色或免疫組化試驗。
【文檔編號】G01N1/36GK103471903SQ201310453621
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】吳天驥 申請人:吳天驥