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用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，涉及激光拉曼光譜的檢測。方法為制備金屬納米粒子為內(nèi)核，滿單層強吸附的陰離子為修飾層的表面改性的納米粒子；將納米粒子溶膠與待測生物分子均勻混合；直接進(jìn)行表面增強拉曼光譜檢測。本發(fā)明用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法操作簡單、快速、成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性好、有效維持生物分子的天然構(gòu)象、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、適于研究生物分子。
【專利說明】用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及激光拉曼光譜的檢測，尤其是涉及一種用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表面增強拉曼光譜(Surface-enhancedRaman Spectroscopy, SERS)是一種具有極高的表面靈敏度的譜學(xué)技術(shù)，可以通過分子的振動特征鑒別吸附在納米結(jié)構(gòu)表面的物種。因此，SERS在物理、化學(xué)、表面科學(xué)、納米科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到了越來越廣泛的關(guān)注。其中，生物醫(yī)學(xué)是一個最受關(guān)注的應(yīng)用領(lǐng)域，因為利用表面增強拉曼光譜不僅可以實現(xiàn)低濃度生物樣品的高靈敏度檢測，還可以在接近生理條件下獲得組織或細(xì)胞的光譜信息，從而從分子水平解釋生命相關(guān)現(xiàn)象。然而，用SERS研究生物體系時往往會遇到重現(xiàn)性差、靈敏度低的問題，大大限制了 SERS技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。所以如何提高生物分子的SERS重現(xiàn)性和靈敏度成為了發(fā)展SERS技術(shù)在生物領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵問題。
[0003]生物分子的SERS重現(xiàn)性和靈敏度低的原因主要來自兩方面，一是生物分子的特性，二是SERS活性納米粒子的界面性質(zhì)。大多數(shù)生物分子的拉曼散射界面較小，在金屬納米粒子的表面吸附比較弱，分子體積通常較大，不容易靠近SERS活性最高的“熱點”，另外它們的結(jié)構(gòu)靈活多變且穩(wěn)定性不高。而SERS活性納米粒子的界面性質(zhì)對靈敏度和重現(xiàn)性的影響更為顯著。因為SERS是一種表面敏感的技術(shù)，所以界面性質(zhì)決定了靠近表面的物種組成、取向以及構(gòu)型，最終決定SERS光譜的特征。另外有研究表明，生物分子與檸檬酸鈉還原的銀納米粒子直接作用容易引起生物分子的構(gòu)象變化甚至變性(S.0ellerich, H.Wackerbarth and P.Hildebrandt，Spectroscopic Characterization of NonnativeConformational States of Cytochrome c.J.Phys.Chem.B，2002，106，6566.)。
[0004]為了提高生物分子的穩(wěn)定性，在測生物分子的SERS時，人們提出樣品應(yīng)該保持在溶膠狀態(tài)而不是完全干的狀態(tài)(X.X.Han, G.G.Huang, B.Zhao, Y.0zaki, Label-Free HighlySensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-EnhancedRaman Scattering.Anal.Chem.2009, 81，3329.)，因為溶液狀態(tài)更接近正常生理狀態(tài)。在溶液狀態(tài)下，蛋白質(zhì)的SERS光譜的重現(xiàn)性相比于干態(tài)有一定提高。
[0005]另一方面，人們想出了各種辦法調(diào)控金屬納米粒子的界面性質(zhì)，從而提高SERS的靈敏度和重現(xiàn)性。人們曾經(jīng)提出用控制電位的方法來控制金屬納米粒子表面的電性，然后通過靜電作用吸引帶相反電荷的目標(biāo)分子(N.S.Lee, Y.Z.Hsieh, R.F.PaisleyandM.D.Morris, Surface-enhanced Raman spectroscopy of the catecholamineneurotransmitters and related compounds.Anal.Chem.，1988，60，442.),從而提高靈敏度和重現(xiàn)性。但是這個方法實際效果有限，操作麻煩，而且電位對生物分子的電荷轉(zhuǎn)移以及結(jié)構(gòu)的影響也不可忽視。2010年，Tian小組提出了用殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜的方法(SHINERS)，在SERS活性納米粒子上包覆一層極薄且無針孔的惰性致密殼層，惰性殼層的隔離可以避免由于生物分子與金屬納米粒子相互作用可能引起的各種變化。所以光譜的穩(wěn)定性和可靠性大大加強，但是惰性殼層厚度至少有2?3nm，而生物分子本身的體積較大，所以將這種方法用于研究生物分子時靈敏度非常低。2011年，巰基十一酸等硫醇類分子被用于納米粒子的表面改性(A.Sivanesan, H.K.Ly, J.Kozuch, M.Sezer, U.Kuhlmann, A.Fischer, 1.M.ffeidinger, Functionalized Ag nanoparticles with tunable opticalproperties forselective protein analysis.Chem.Commun.2011，47，3553.X 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在硫醇修飾的納米粒子上，細(xì)胞色素c的表面增強共振拉曼光譜重現(xiàn)性很好，而且保全了蛋白分子的天然構(gòu)象。硫醇修飾層的厚度大約在Inm以內(nèi)，相比于SHINERS其厚度明顯降低，所以靈敏度也明顯提高。但是該方法的缺點是，硫醇分子本身也會產(chǎn)生很強的SERS信號干擾目標(biāo)分子的信號，當(dāng)應(yīng)用于大多數(shù)沒有共振效應(yīng)的普通生物分子時，這種干擾就會非常明顯。所以需要在綜合前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)，發(fā)明新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、快速、成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性好、有效維持生物分子的天然構(gòu)象、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的、適于研究生物分子的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]首先制備金屬納米粒子為內(nèi)核，滿單層強吸附的陰離子為修飾層的表面改性的納米粒子；然后將納米粒子溶膠與待測生物分子均勻混合；直接進(jìn)行表面增強拉曼光譜檢測。
[0009]本發(fā)明包括以下步驟:
[0010]I)制備金屬納米粒子為內(nèi)核，陰離子為修飾層的表面改性的納米粒子；
[0011]2)將納米粒子溶膠與待測分子均勻混合；
[0012]3)進(jìn)行表面增強拉曼光譜檢測。
[0013]所述金屬納米粒子最好為銀納米粒子、金納米粒子或銅納米粒子等具有顯著表面等離子體共振性質(zhì)的金屬納米粒子。
[0014]所述金屬納米粒子最好為球形或棒狀等各種形狀的金屬納米粒子，所述金屬納米粒子的粒徑最好為10?300nm。
[0015]所述陰離子最好為碘離子、溴離子、氯離子或者硫離子等在金屬表面強吸附的陰離子。
[0016]一種用于增強拉曼光譜檢測的納米粒子，其特征在于:其內(nèi)核為金屬納米粒子，該內(nèi)核上修飾有陰離子，所述陰離子為碘離子、溴離子、氯離子或者硫離子。
[0017]所述金屬納米粒子為銀納米粒子、金納米粒子或銅納米粒子。
[0018]修飾的陰離子的量可以為滿單層吸附量的0.1-10倍。最好為滿單層。
[0019]本發(fā)明的原理是:
[0020]在高SERS活性的金屬(銀、金、銅)納米粒子上修飾滿單層的陰離子(碘離子、溴離子、氯離子、硫離子等)，即得到一個表面干凈，界面性質(zhì)單一的納米粒子，然后將該納米粒子與待測樣分子混合，因為有表面陰離子層的隔離，生物分子不容易直接跟金屬納米粒子發(fā)生相互作用，從而影響其構(gòu)象。如果待測分子帶正電，那么由于靜電作用，分子靠近帶負(fù)電的粒子表面并誘導(dǎo)粒子發(fā)生聚集，形成熱點并將分子包含在其中。如果待測分子帶負(fù)電，那么在加入待測分子之后，再加入MgSO4等聚集劑也可以誘導(dǎo)粒子形成熱點。所以無論待測分子的電性如何，都可以給出強的SERS信號。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點和技術(shù)效果:
[0022]I)本發(fā)明的陰離子修飾納米粒子的制備方法及原材料簡單易得，其中金屬拉曼粒子的大小以及修飾的完整程度都是可控的。
[0023]2)本發(fā)明與SHINERS技術(shù)相比較，靈敏度有很大提高。
[0024]3)本發(fā)明與硫醇類分子修飾方法相比較，不存在修飾層分子信號的干擾，因為Ag-1，Ag-Br只在2000^1以下的低波速區(qū)有單一的振動。
[0025]4)本發(fā)明克服了以往SERS應(yīng)用于生物領(lǐng)域的兩大問題:重現(xiàn)性和靈敏度。不僅如此，本方法還能測到生物分子的天然構(gòu)象。 [0026]5)本發(fā)明不僅可以得到單一生物分子的可靠的SERS光譜，還可以得到多組分生物分子的可靠的SERS光譜。
[0027]6)本發(fā)明使得SERS技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍拓寬，為真正使SERS這種高靈敏的檢測技術(shù)普遍應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為制備陰離子修飾納米粒子的實驗流程示意圖。
[0029]圖2為碘離子修飾銀納米粒子前后的掃描電子顯微鏡圖(SEM)，紫外可見光譜以及SERS譜圖。
[0030]圖3為確定陰離子滿單層吸附的量，對比不同修飾程度的SERS效果。
[0031]圖4為溶菌酶分子的常規(guī)拉曼，在陰離子修飾納米粒子上的SERS，在無修飾的納米粒子上的SERS比較。
[0032]圖5為本發(fā)明的方法的重現(xiàn)性及靈敏度表征。
[0033]圖6為用本發(fā)明方法測得的混合蛋白質(zhì)的SERS譜圖
[0034]圖7為用本發(fā)明方法測得的血清的SERS譜圖
[0035]圖8為實施例7、8、9的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0037]實施例1
[0038]一種陰離子修飾納米粒子的制備:
[0039]圖1給出制備陰離子修飾納米粒子的實驗流程示意圖。
[0040]以碘離子修飾銀納米粒子為例，其具體制備方法是:
[0041]取200mL濃度為ImM的硝酸銀溶液，攪拌條件下加熱至沸騰，然后加入6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉水溶液，并保持微沸l(wèi)h，溶液最終變?yōu)辄S綠色。自然冷卻至室溫，即得直徑約為50nm的銀納米粒子溶膠。取4.5mL銀納米粒子溶膠,室溫離心(5000r/min, IOmin),去上清液，使納米粒子溶膠濃縮至約50 yL。加入50 ii LlmM KI，混合均勻，25°C下靜置20min，使碘離子在銀納米粒子表面滿單層吸附，得到碘離子修飾的銀納米粒子溶膠。
[0042]圖2A是碘離子修飾銀納米粒子前后的紫外可見光譜，從該譜圖可以看出碘離子修飾前后，銀納米粒子溶膠的紫外可見吸收峰并沒有明顯位移，峰寬也沒有明顯變化，說明碘離子的加入并沒有引起銀納米粒子的明顯團(tuán)聚。
[0043]圖2B是碘離子修飾銀納米粒子前后的SERS譜圖。在圖2B中，橫坐標(biāo)是拉曼位移，縱坐標(biāo)是拉曼強度。曲線a代表碘離子修飾銀納米粒子前的SERS譜圖，幾乎看不到SERS譜峰。曲線b代表碘離子修飾銀納米粒子后SERS譜圖，在lOScnT1處出現(xiàn)的強峰歸屬于Ag-1的振動，說明碘離子已經(jīng)有效的修飾到納米粒子表面。同時在200?lSOOcnT1范圍內(nèi)沒有明顯的峰出現(xiàn)，保證了這種碘離子修飾的納米粒子對后續(xù)的物種檢測不會有譜峰干擾。
[0044]實施例2
[0045]檢驗陰離子是否滿單層修飾，并對比不同修飾程度的納米粒子用于蛋白質(zhì)SERS檢測的效果:
[0046]取1.5mL銀納米粒子溶膠,室溫離心(5000r/min, IOmin),去上清液,再加入超純水使納米粒子溶膠的體積為1.5mL,檢測溶膠的zeta電位值。連續(xù)向該溶膠中加入5 μ LlmMKI溶液，每次加完之后在25°C下平衡IOmin,然后檢測溶膠的zeta電位值。每個樣品點都連續(xù)測5次，取平均值。
[0047]取4.5mL銀納米粒子溶膠,室溫離心(5000r/min, IOmin),去上清液,使納米粒子溶膠濃縮至約50 μ L。分別加入50 μ L不同濃度的KI溶液，混合均勻，25°C下靜置20min，然后與50μ Llmg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，轉(zhuǎn)移到96孔板中，立即檢測SERS。
[0048]圖3A是zeta電位的結(jié)果,可見,對于1.5mL銀納米粒子溶膠來說，當(dāng)ImM KI的量達(dá)到15?20μ L時，碘離子在納米粒子表面達(dá)到飽和吸附，近似于滿單層吸附。所以我們SERS實驗中用的4.5mL銀納米粒子溶膠對應(yīng)的ImM KI的飽和吸附量是45?60 μ L,我們實際的用量50 μ L在此范圍內(nèi)。
[0049]圖3Β是不同修飾程度的納米粒子用于蛋白質(zhì)SERS檢測的效果對比。曲線a、b、c、d分別代表所用的KI的濃度依次為0mM，0.1mM, ImM, 10mM。當(dāng)加入KI的量約等于滿單層吸附所需的量(50 μ L，ImM)時，溶菌酶蛋白的SERS光譜質(zhì)量最好。當(dāng)KI不足時，容易得到碳包而得不到蛋白質(zhì)的信號，當(dāng)KI過量10倍時，蛋白質(zhì)的信號強度有所降低。
[0050]實施例3
[0051]利用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法研究蛋白分子，以溶菌酶分子為例，對比溶菌酶分子的常規(guī)拉曼，在陰離子修飾納米粒子上的SERS以及在無修飾的納米粒子上的SERS:
[0052]合成了碘離子修飾的銀納米粒子和不經(jīng)過修飾的銀納米粒子，分別與50 μ Llmg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行表面增強拉曼測試。另取適量的100mg/mL的溶菌酶溶液于96孔板中進(jìn)行常規(guī)拉曼測試。
[0053]圖4是實施例3的實驗結(jié)果。圖4中曲線a代表溶菌酶溶液的常規(guī)拉曼譜圖，曲線b代表溶菌酶在碘離子修飾銀納米粒子上的SERS譜圖，對比a和b可以發(fā)現(xiàn)，溶菌酶在陰離子修飾納米粒子上的SERS譜圖與其常規(guī)拉曼譜圖特征非常相似，而強度平均增強了約1200倍。曲線c代表同樣的測試條件下溶菌酶在無修飾的銀納米粒子上的SERS譜圖，其特征與常規(guī)拉曼譜圖特征差別較大。
[0054]實施例4
[0055]考察利用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法的重現(xiàn)性和靈敏度:[0056]將碘離子修飾的銀納米粒子與50y Llmg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行表面增強拉曼測試。連續(xù)采譜10次。
[0057]將碘離子修飾的銀納米粒子與50 y L不同濃度的溶菌酶溶液充分混合，溶菌酶的最終濃度分別為300 V- g/mL, 30 V- g/mL, 3 u g/mL, 0.3 u g/mL,轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行表面增
強拉曼測試。
[0058]圖5是實施例4的實驗結(jié)果。圖5A中，10條曲線依次代表10次連續(xù)采譜的結(jié)果，它們基本上相互重合，說明本發(fā)明方法的重現(xiàn)性非常好。圖5B中表明對于溶菌酶的SERS檢測，檢測限低至g/mL，靈敏度較高。
[0059]實施例5
[0060]利用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，進(jìn)行混合蛋白質(zhì)的檢測:
[0061]以細(xì)胞色素c和溶菌酶的二元混合蛋白為例，將碘離子修飾的銀納米粒子分別與50 u L細(xì)胞色素C，50 ii L溶菌酶，以及50 ii L細(xì)胞色素c和溶菌酶的混合溶液充分混合，它們的最終濃度分別為3 V- g/mL, 300 u g/mL, 1.5 u g/mL: 15 u g/mL,然后分別轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行表面增強拉曼測試。
[0062]圖6是實施例5的結(jié)果。如圖6所示，細(xì)胞色素c和溶菌酶的混合溶液也可以得到質(zhì)量很好的SERS譜圖，而且細(xì)胞色素c和溶菌酶的各自的譜峰特征都非常明顯。
[0063]實施例6
[0064]利用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，進(jìn)行的血清的SERS檢測:
[0065]將碘離子修飾的銀納米粒子與50 U L10%的胎牛血清充分混合，轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行表面增強拉曼測試。
[0066]圖1是實施例6的結(jié)果。在圖7中，lOOOcnT1，1030cm^是血清中主要成分牛血清白蛋白的特征峰，說明血清雖然成分復(fù)雜，但是真正與碘離子修飾的銀納米粒子發(fā)生作用的主要還是牛血清白蛋白。這一結(jié)果也表明本發(fā)明的方法在血清等成分復(fù)雜的樣品上也可以得到可靠的結(jié)果。
[0067]實施例7
[0068]溴離子修飾的方法
[0069]方法步驟同實施例1和實施例2，只是將原來ImM KI換成ImM KBr,以溶菌酶蛋白為檢測分子。
[0070]實施例8
[0071]氯離子修飾的方法
[0072]方法步驟同實施例1和實施例2，只是將原來ImM KI換成ImM KCl,以溶菌酶蛋白為檢測分子。
[0073]實施例9
[0074]硫離子修飾的方法
[0075]方法步驟同實施例1和實施例2，只是將原來ImM KI換成ImM Na2S,以溶菌酶蛋白為檢測分子。
[0076]圖8是實施例7、8、9的結(jié)果。 如圖8所示，a是碘離子修飾的方法的檢測結(jié)果，作為對比和參考；b是溴離子修飾的方法的檢測結(jié)果；c是氯離子修飾的方法的檢測結(jié)果；d是硫離子修飾的方法的檢測結(jié)果，為了看得更清楚，信號強度放大了 5倍。從這4條譜圖對比發(fā)現(xiàn)，碘離子、溴離子、氯離子和硫離子等陰離子修飾納米粒子之后，都可以得到特征與常規(guī)拉曼相似的可靠的蛋白質(zhì)SERS譜圖，但是同等條件下，碘離子修飾的方法得到譜圖信噪比最好，信號最強。
[0077]上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)說作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)制備金屬納米粒子為內(nèi)核，陰離子為修飾層的表面改性的納米粒子； 2)將納米粒子溶膠與待測分子均勻混合； 3)進(jìn)行表面增強拉曼光譜檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述金屬納米粒子為銀納米粒子、金納米粒子或銅納米粒子。
3.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述金屬納米粒子為球形金屬納米粒子或棒狀金屬納米粒子。
4.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述金屬納米粒子的粒徑為10~300nm。
5.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述陰離子為碘離子、溴離子、氯離子或者硫離子。
6.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述陰離子修飾的程度為滿單層的0.1-10倍。
7.如權(quán)利要求1所述的用陰離子修飾納米粒子增強拉曼光譜的方法，其特征在于所述陰離子修飾的程度為滿單層。
8.一種用于增強拉曼光譜檢測的納米粒子，其特征在于:其內(nèi)核為金屬納米粒子，該內(nèi)核上修飾有陰離子，所述陰離子為碘離子、溴離子、氯離子或者硫離子。
9.如權(quán)利要求8所述的一種用于增強拉曼光譜檢測的納米粒子，其特征在于:所述金屬納米粒子為銀納米粒子、金納米粒子或銅納米粒子。
10.如權(quán)利要求8所述的一種用于增強拉曼光譜檢測的納米粒子，其特征在于:修飾的陰離子的量為滿單層吸附量的0.1-10倍。
【文檔編號】G01N21/65GK103604798SQ201310651346
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】任斌, 許麗佳, 宗鋮, 鄭曉姍, 胡佩 申請人:廈門大學(xué)