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檢測莫能菌素的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測莫能菌素的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標記物是異魯米諾發(fā)光標記物標記的莫能菌素半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的莫能菌素單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中莫能菌素的方法，本方法對莫能菌素檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
【專利說明】檢測莫能菌素的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種直接化學發(fā)光檢測試劑盒及其檢測方法。特別是檢測動物組織、飼料等樣本中莫能菌素藥物殘留的磁顆粒競爭直接化學發(fā)光檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]莫能菌素(Monensin)是聚醚類抗生素，被廣泛用于動物疾病的治療，其主要作用機理是干擾球蟲細胞內(nèi)鈉鉀離子的正常交換，是大量的鈉離子進入細胞內(nèi)，造成鈉離子在胞內(nèi)濃度高，滲透壓上升，跟多的水分進圖球蟲內(nèi)，為了排除細胞內(nèi)多余的鈉，球蟲必須動用能量將多余的鈉外泵排除，最終造成有限的能量被用完；而后鈉鉀離子交換中斷停止，細胞膨脹、變形、破裂、崩解。莫能菌素還可以影響反芻動物瘤胃內(nèi)能量代謝，改善瘤胃發(fā)酵，提高丙酸與乙酸的產(chǎn)出比例，降低揮發(fā)性脂肪酸，減少甲烷生成，提高蛋白質(zhì)利用效率。因此能夠顯著提高反芻動物的飼料利用率和促進生長的作用。但是莫能菌素在動物食品中的殘留會影響人類健康，因此，歐美國家及我國均規(guī)定了莫能菌素在動物組織中的最大殘留量。
[0003]目前，莫能菌素藥物的殘留檢測主要采用高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附法等方法。
[0004]1、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精度高、假陽性率低的特點。HPLC法的主要缺點是儀器價格昂貴，操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復雜。
[0005]2、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)靈敏度很高，假陽性率低。該方法的主要缺點是樣品需要衍生化這樣復雜的前期處理。雖然經(jīng)過衍生化處理的樣品能在質(zhì)譜中給出更多的結(jié)構(gòu)信息，但是衍生化會產(chǎn)生多個不同的產(chǎn)物并導致樣品的部分丟失，造成實驗結(jié)果的偏差。
[0006]3、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測，最早應用于傳染病、腫瘤標志物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領域推廣應用，目前依托ELISA技術的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測領域的主導產(chǎn)品，同時也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測法基于抗原-抗體的特異性反應，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術的發(fā)展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在:
[0007]I)非均相反應:檢測過程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過程，耗時費力，難以提高操作的自動化程度。
[0008]2)酶催化反應:借助酶催化底物顯色，測定反應液吸光度值。反應的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種檢測莫能菌素的化學發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進行莫能菌素的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應速度。
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種莫能菌素的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。
[0011]實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種莫能菌素檢測試劑盒，其包含的主要試劑有:發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。
[0012]所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。
[0013]所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。
[0014]所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的莫能菌素半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABE1、AHEI 或 ABEN。
[0015]所述的試劑盒還包括標準品,質(zhì)控品和濃縮洗液。
[0016]所述的熒光素標記物是FITC標記莫能菌素單克隆抗體。
[0017]本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測莫能菌素的方法，包括下列步驟:
[0018]I)分別吸取20μ1_100μ1標準品或樣本，然后加入20μ1_100μ1發(fā)光標記物，再加20μ1-100μ1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；
[0019]2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80_150μ1，混勻后在37°C溫育5min ；
[0020]3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300_500μ1沖洗復合物沉淀；
[0021]4)上述清洗步驟重復2-4次；
[0022]5)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算莫能菌素的濃度。
[0023]所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。
[0024]本發(fā)明中分析測試方法所用的分析儀是:包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結(jié)果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所采用的系統(tǒng)是C1-2008系統(tǒng)。
[0025]本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是
0.1-0.3eqm/g,其保存于含有 8-10% 卵清蛋白，0.05-0.10%Tween_20,0.02-0.04%NaN3,pH7.2的PBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0026]所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物ABE1、AHEI或ABEN標記的莫能菌素半抗原，其保存于含PH7.2,0.1-0.3%Tween-20,0.01%NaN3的PBS緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
[0027]所述的熒光素標記物是FITC標記的莫能菌素單克隆抗體，其保存于PH7.2，含5-8%牛血清白蛋白，0.02-0.04%NaN3的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0028]莫能菌素標準品溶液(0ng/ml,0.02ng/ml, 0.06ng/ml, 0.18ng/ml, 0.54ng/ml,1.6ng/ml)，標準品稀釋液為pH7.2,0.03%NaN3,0.lmol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)
量百分含量。
[0029]莫能菌素質(zhì)控品溶液濃度分別為0.05ng/ml, 1.0ng/ml,質(zhì)控品稀釋液ρΗ7.2，
0.03%NaN3,0.lmol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0030]所述的濃縮洗液為pH7.2,0.2-0.4%Tween_20,0.02-0.04% NaN3,0.1-0.2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0031]本發(fā)明的有益效果如下:
[0032]I)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測莫能菌素。
[0033]2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對莫能菌素的檢測靈敏度可達0.02g/ml。
[0034]3)本發(fā)明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。
【具體實施方式】
[0035]實施例一試劑盒具體組分的制備
[0036]I)莫能菌素人工抗原的制備
[0037]將莫能菌素與牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法(NHS-DCC)進行偶聯(lián)得到免疫原。
[0038]3)單克隆抗體的制備
[0039]動物免疫:以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0040]細胞融合和克隆化:取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0041]細胞凍存和復蘇:將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0042]單克隆抗體的制備與純化:將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。
[0043]4)發(fā)光標記物的制備
[0044]取4.5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5.0mmol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于
0.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應3-4h。取上述制備的莫能菌素半抗原15mg，用pH7.4 PBS調(diào)節(jié)體積到1.5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。
[0045]5)熒光標記物制備
[0046]用0.025mol/L, pH9.0的碳酸鹽緩沖液將莫能菌素單克隆抗體稀釋成1.0%質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0.0lmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成0.lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4~C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7.4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過SephadexG-25或G_50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。
[0047]6)分離試劑制備
[0048]a)磁珠活化
[0049]表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2.8 μ m)，其含量是0.15eq/g;取100 μ I磁珠，用 100 μ I 25mmol/L, pH5.0, 0.05%Tween_20 MES溶液洗滌兩次，磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置于磁分離架上磁分離4min，移除上清，加入100μ l,25mmol/L, pH5.0, MES清洗2-3次后即可得表面羧基活化的磁珠。
[0050]b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體
[0051]將50-100μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60μ l，25mmol/L，pH5.0 MES中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4V偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7.4，TRIS反應15min或100μ 1，ρΗ8.0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0.1-0.3%BSA, 0.l%Tween_20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復溶于含0.1-0.5%BSA,
0.01-0.l%Tween-20,0.02%NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。
[0052]實施例二試劑盒的組建
[0053]組建檢測莫能菌素的磁顆粒直接競爭化學發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分:
[0054]FITC標記的莫能菌素單克隆抗體的熒光標記物
[0055]ABEI標記的莫能菌素半抗原的發(fā)光標記物
[0056]表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑
[0057]莫能菌素標準品溶液(Ong/ml,0.02ng/ml, 0.06ng/ml, 0.18ng/ml, 0.54ng/ml,1.6叩/1111)，標準品稀釋液為？!17.2，0.03%似乂，0.lmol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0058]莫能菌素質(zhì)控品溶液濃度分別為0.05ng/ml，1.0ng/ml，質(zhì)控品稀釋液ρΗ7.2，
0.03%NaN3,0.lmol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0059]濃縮洗液為pH7.2,0.2-0.4%Tween_20,0.02-0.04% NaN3,0.1-0.2mol/L PBS 緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
[0060]實施例三實際樣品中莫能菌素的檢測
[0061]1、樣本前處理
[0062](一)豬肉/肝前處理方法
[0063]用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml甲醇，再加入Iml去離子水，振蕩5min,3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min ;取2ml上清液至50ml塑料離心管中，加入2ml IM氫氧化鈉溶液混勻，再加入6ml正己烷，渦動3min，3000g以上，室溫(20-25°C)離心5min ;取3ml上清液至IOml玻璃試管中，于50~60°C氮氣流下吹干，加入Iml復溶工作液渦動2~3min ;取50μ1用于分析，樣本稀釋倍數(shù):2。
[0064](二)雞肉/肝前處理方法
[0065]用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml甲醇，再加入Iml去離子水，振蕩5min,3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min ;取2ml上清液至50ml塑料離心管中，加入Iml 2M氫氧化鈉溶液混勻，再加入6ml正己烷，渦動3min，3000g以上，室溫(20-25°C)離心5min ;取3ml上清液至IOml玻璃試管中，于50?60°C氮氣流下吹干，加入Iml復溶工作液渦動2?3min ;取50μ1用于分析，樣本稀釋倍數(shù):2。
[0066]2、用試劑盒檢測與結(jié)果分析
[0067]分別吸取20μ1_100μ1標準品或樣本，然后加入20μ1_100μ1發(fā)光標記物，再加20μ1-100μ1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻后在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ1沖洗復合物沉淀；所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中莫能菌素的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU結(jié)合標準曲線法計算莫能菌素的濃度。
[0068]激發(fā)底物I是NaOH，激發(fā)底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10-20遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強堿溶液腐蝕底物泵。
[0069]本發(fā)明米用6 個莫能菌素標準品(Ong/ml, 0.02ng/ml, 0.06ng/ml, 0.18ng/ml,
0.54ng/ml, 1.6ng/ml)進行曲線測繪。儀器根據(jù)所述方法檢測得到一條RLU值與莫能菌素濃度相關的定標曲線，此后測量中，每一個樣本中的莫能菌素濃度與標準曲線相比較得出樣本中的莫能菌素含量。
[0070]實施例四試劑盒質(zhì)量的測定
[0071]1、試劑盒的靈敏度
[0072]試劑盒靈敏度的定義為:測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為0.02ng/ml。
[0073]2、樣本的準確度和精密度
[0074]準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重復性，常用變異系數(shù)表示。
[0075]按照實施例三的樣本提取方法，以0.08ng/g、0.16ng/g兩個濃度的莫能菌素分別對雞肉、豬肉樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結(jié)果見下表。
[0076]表I 準確度和精密度測定 ng/g
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測莫能菌素的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有:發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的莫能菌素半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述的異魯米諾發(fā)光標記物是ABE1、AHEI 或 AffiN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒還包括標準液、質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于:所述的熒光素標記物是FITC標記的莫能菌素單克隆抗體。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測莫能菌素的方法，包括下列步驟: O分別吸取20μ1-100μ1標準品或樣本，然后加入20μ1_100μ1發(fā)光標記物，再加20μ1-100μ1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ； 2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻后在37°C溫育5min ； 3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300_500μ1沖洗復合物沉淀； 4)上述清洗步驟重復2-4次； 5)4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3_5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中莫能菌素的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算莫能菌素的濃度。
【文檔編號】G01N33/577GK103592435SQ201210290312
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月15日
【發(fā)明者】何方洋, 周德剛, 馮靜, 岳欣榮, 韓京朋, 余厚美 申請人:北京勤邦生物技術有限公司