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一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子及其在監(jiān)測酶活性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子及其在監(jiān)測酶活性中的應(yīng)用，該酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子由水解酶的作用底物分子連接聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子構(gòu)成，其在水解酶的作用下水解后會聚集誘導(dǎo)發(fā)光，將其摻入活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測可以反映水解酶活性水平，本發(fā)明尤其可以用于細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的長時間的時空監(jiān)測。
【專利說明】一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子及其在監(jiān)測酶活性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶活性監(jiān)測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子及其在監(jiān)測酶活性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]任何一個細(xì)胞都由動態(tài)的脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、核酸和糖類等結(jié)構(gòu)功能精確可調(diào)、且結(jié)構(gòu)有序的大分子和小分子構(gòu)成。它們的復(fù)雜性和多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們現(xiàn)有的認(rèn)知范圍。但是眾所周知，細(xì)胞的狀態(tài)直接反映著生物體的狀態(tài)，因此人類必須要想盡各種各樣的辦法來認(rèn)識和了解無處不在的生物體，包括我們?nèi)祟愖约?。認(rèn)識了解細(xì)胞內(nèi)分子間或分子組裝體間的相互作用是我們認(rèn)知細(xì)胞的一種方法，這不僅有利于我們了解生命現(xiàn)象，同時也有利于我們更好的診斷和糾正自己。配合著快速發(fā)展的計算機(jī)模擬技術(shù)，之前的報道借助體外模型展示了多肽聚集體、納米膠和響應(yīng)型水凝膠，對我們認(rèn)識和理解活細(xì)胞內(nèi)的組裝過程提供了非常有價值的信息。盡管如此，以上的信息，仍無法清晰地展示給我們細(xì)胞內(nèi)相互作用過程。
[0003]最近，借助酶響應(yīng)水凝膠，高遠(yuǎn)等人建立了一個最小的模型來研究細(xì)胞內(nèi)的組裝。將發(fā)色團(tuán)連至水凝膠前驅(qū)體后，實(shí)現(xiàn)了水凝膠細(xì)胞內(nèi)組裝時空分布的可視化。盡管這一工作揭示了小分子在活細(xì)胞中組裝的可能性，但是它仍無法幫助我們直接地認(rèn)識生物化學(xué)過程，例如細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的時空可視。
[0004]細(xì)胞中很多多肽或蛋白的反應(yīng)過程在生命演繹中扮演著至關(guān)重要的角色。例如近乎三分之一的細(xì)胞多肽功能都是被磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)。傳統(tǒng)的經(jīng)典生物化學(xué)方法只能簡單的揭示整體的細(xì)胞內(nèi)磷酸化活性水平，但是無法給出磷酸蛋白活性的細(xì)節(jié)數(shù)據(jù)，更無法給出細(xì)胞內(nèi)磷酸蛋白活性的任何時空信息。實(shí)際上，細(xì)胞內(nèi)的多肽或蛋白酶多種多樣，至今我們還沒有也無法認(rèn)知任何一種細(xì)胞內(nèi)的酶活性水平的時空分布。
[0005]熒光顯微技術(shù)或許是最適合研究細(xì)胞內(nèi)分子過程的時空動力學(xué)的方法。借助傳統(tǒng)的熒光分子和熒光顯微技術(shù)，我們成功觀察到很多有趣的細(xì)胞現(xiàn)象。但是要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生化過程的時空觀察，傳統(tǒng)熒光分子卻顯示了其弊端一聚集誘導(dǎo)發(fā)光淬滅和光淬滅現(xiàn)象。例如在借助綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)融合蛋白方法全面觀察釀酒酵母中蛋白位置的過程中，常會出現(xiàn)蛋白的錯誤定位，原因就是在于大的GFP端(27kD)的存在。但由于這是發(fā)光分子固有的屬性，人們不得不付出很多的努力去找到上述問題的解決辦法。
[0006]2001年，唐本忠教授等報道了( Chem.Commun.2001,1740) —種與聚集誘導(dǎo)突光淬滅(Aggregation caused quenching, ACQ)完全不同的光物理現(xiàn)象一聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-1nduced emission,AIE)效應(yīng):一類具有螺旋槳狀的分子在溶液狀態(tài)下不發(fā)射熒光，而在聚集態(tài)下材料的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而且聚集程度越高熒光越強(qiáng)。隨后，很多聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子及其合成技術(shù)被報道公開。聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子的出現(xiàn)為生物成像帶來了曙光。這類分子的發(fā)光是源于單個的無輻射發(fā)色團(tuán)的聚集所導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)受限。發(fā)光強(qiáng)度與聚集的程度相關(guān)，相同的條件下，聚集越嚴(yán)重發(fā)光越強(qiáng)。與傳統(tǒng)的聚集誘導(dǎo)淬滅分子比較，具有誘導(dǎo)發(fā)光分子展現(xiàn)了多個優(yōu)點(diǎn)，包括高的發(fā)光效率、大的stokes位移以及抗淬滅。最重要的是，由于它們小分子的結(jié)構(gòu)，使它們能夠自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而且很容易根據(jù)需要進(jìn)行裁剪。因此它們是一類新穎適合于細(xì)胞時空分布觀察的發(fā)光分子。
[0007]合成具有生物相容性和靶向酶響應(yīng)性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子，這類分子可分散于溶液中，并自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，這些不發(fā)光的分子在到達(dá)酶響應(yīng)位點(diǎn)后發(fā)生反應(yīng)，并誘導(dǎo)分子的聚集和結(jié)構(gòu)的受限和熒光的發(fā)出。細(xì)胞內(nèi)的酶反應(yīng)過程多是可逆的，因此相應(yīng)位點(diǎn)的酶活性水平直接影響分子的聚集，而細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度直接反映出相應(yīng)位點(diǎn)的酶活性水平。這種可同時應(yīng)用于單細(xì)胞位點(diǎn)和酶反應(yīng)過程時空監(jiān)控的技術(shù)方法目前還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子及其在監(jiān)測酶活性中的應(yīng)用，這種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子在水解酶的作用下水解后會聚集誘導(dǎo)發(fā)光，避免了傳統(tǒng)發(fā)光分子的聚集誘導(dǎo)發(fā)光淬滅和光淬滅現(xiàn)象，適合水解酶活性水平的長時間時空監(jiān)測；而且其生物相容性強(qiáng)，可以自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空監(jiān)測。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下內(nèi)容:
[0010]在第一方面，本發(fā)明提供一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子，其由水解酶的作用底物分子連接聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子構(gòu)成。
[0011]水解酶是催化水解反應(yīng)的一類酶的總稱，也可以說它們是一類特殊的轉(zhuǎn)移酶，用水作為被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的受體。本發(fā)明對細(xì)胞內(nèi)的各種蛋白酶或多肽酶及其它影響生命過程的水解酶類普遍適用。水解酶的典型但非限定性的實(shí)例包括磷酸酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶或泛素羧基末端水解酶等，其中磷酸酶可以包括酸性磷酸酶和堿性磷酸酶；本發(fā)明優(yōu)選磷酸酶，更優(yōu)選堿性磷酸酶。
[0012]在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，示出了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、酪氨酸蛋白憐酸酶 lB(Protein Tyrosine PhosphataselB,PTPlB)和蛋白憐酸酶 2A(Proteinphosphatase2A, PP2A)的例子。
[0013]本發(fā)明對底物分子不作特別限定，與特定的水解酶對應(yīng)的底物分子可以是多肽、蛋白、寡糖或核苷酸等。多肽和蛋白質(zhì)可以是任意具有水解酶響應(yīng)位點(diǎn)和特定氨基酸序列的修飾或未修飾的形式，可以是天然的或者人工合成的。本發(fā)明的多肽類底物分子是對多個氨基酸經(jīng)過氨基羧基的縮合而成的產(chǎn)物，分子量一般認(rèn)為在4000以下，主要由碳、氫與氧三種元素所組成，另含有少數(shù)硫、磷和硒等元素，廣布自然界。寡糖，又稱低聚糖，一般是指含有2-10個糖苷鍵聚合而成的化合物，按照糖苷鍵的類型可以是N-糖苷鍵或O-糖苷鍵型。作為底物分子，本發(fā)明優(yōu)選多肽，并且特別優(yōu)選YpYY肽序列，其中Y代表酪氨酸、P代表磷酸基團(tuán)。
[0014]在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，示出了多肽類型的底物分子:YpYY、DADEpYL和TPE-RRREEEpTEEEAA，其中p代表磷酸基團(tuán)，其它字母代表通常意義上的氨基酸單字母表示法對應(yīng)的氨基酸。這些序列均具有磷酸基團(tuán)，當(dāng)該磷酸基團(tuán)在水解酶的作用下水解失去時，酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子會聚集誘導(dǎo)發(fā)光。
[0015]聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子是指在分離情況下不發(fā)光，而在聚集狀態(tài)下誘導(dǎo)發(fā)出熒光現(xiàn)象的分子，目前已經(jīng)由很多類型的這類分子報道，比如中國發(fā)明專利申請公布號 CN102153748A、CN102279270A、CN102250015A、CN102313726A、CN102702096A、CN103194213A.CN103194215A和CN102219723A均公開了相應(yīng)的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子，理論上說這些類型的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子都能應(yīng)用于本發(fā)明。雖然如此，本發(fā)明特別優(yōu)選的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子是四苯基乙烯(Tetraphenylethylene,TPE)及其衍生物或噻咯(silole)類,最優(yōu)選的是TPE。
[0016]任何能夠?qū)⒌孜锓肿优c聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子連接而形成酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子的方法均可適用本發(fā)明，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可。雖然如此，本發(fā)明的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子是由水解酶的作用底物分子與聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子通過酰胺反應(yīng)或點(diǎn)擊(Click)反應(yīng)生成的。點(diǎn)擊反應(yīng)是指，通過小的基本單元(如氨基酸或單糖等)的不斷拼接，快速可靠地完成形形色色分子(如蛋白質(zhì)或多糖等)的化學(xué)合成，是一類速度快、產(chǎn)率高的化學(xué)反應(yīng)類型，典型的有:環(huán)加成反應(yīng)、親核開環(huán)反應(yīng)、非醇醛的羰基化學(xué)以及碳碳多鍵的加成反應(yīng)等，目前廣泛應(yīng)用于光電功能分子材料中。通過酰胺反應(yīng)或點(diǎn)擊反應(yīng)將多肽與聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子連接，同時實(shí)現(xiàn)了發(fā)光分子生物相容性的提高、特異性酶響應(yīng)性和酶活性熒光標(biāo)記三種功能。本發(fā)明提供的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子在特定水解酶的作用下水解，繼而發(fā)生聚集，從而誘導(dǎo)發(fā)光，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平。
[0017]在第二方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測酶活性水平的方法，所述方法為:將上述酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子摻入活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平。
[0018]本發(fā)明提供的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子的生物相容性優(yōu)異，可以很容易地進(jìn)入細(xì)胞中，在酶反應(yīng)活性位點(diǎn)被水解而聚集發(fā)出熒光，從而能夠通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平在時間和空間兩個維度上的分布情況。
[0019]因此本發(fā)明的一個特別方案是:將所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子摻入活細(xì)胞中，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空分布，即細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平隨時間的變化和水解酶在細(xì)胞內(nèi)的空間分布。
[0020]熒光顯微技術(shù)是目前非常成熟的研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的定性和定位的工具，借助于熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像而實(shí)現(xiàn)。
[0021]在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，研究了特定酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子在大鼠原代成骨細(xì)胞、人Hela細(xì)胞和MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)酶活性時空分布情況的監(jiān)測?？梢酝普摫景l(fā)明提供的監(jiān)測酶活性水平的方法可以廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞內(nèi)水解酶活性的監(jiān)測，而不局限于這幾種。
[0022]細(xì)胞外反應(yīng)體系是一種比較成熟的研究系統(tǒng)，它通過對細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的模擬，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外合成生物大分子(比如多肽)等等多種生化過程的研究。本發(fā)明毫無疑問也可以適用于細(xì)胞外反應(yīng)體系，因為在適合的細(xì)胞外反應(yīng)體系中酶的活性并不喪失，而且可以精確調(diào)控，聚集誘導(dǎo)發(fā)光顯現(xiàn)依然存在。
[0023]各種酶均有相應(yīng)的抑制劑，如果使用特定的抑制劑處理這種酶能夠顯著抑制酶的活性，水解酶也不例外。已經(jīng)論述水解酶的活性水平可以通過上述酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子進(jìn)行監(jiān)測，因此本發(fā)明也可以用于研究特定抑制劑對水解酶的抑制作用。[0024]因此，本發(fā)明特別提供一個技術(shù)方案是:在摻入所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子之前或者之后，向活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中摻入相應(yīng)水解酶的抑制齊U，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映抑制劑對相應(yīng)水解酶的活性抑制。
[0025]本發(fā)明中，所述抑制劑可以針對相應(yīng)水解酶的藥物分子。這樣就可以應(yīng)用于藥物篩選中。例如，在篩選酪氨酸磷酸酶抑制劑時，將磷酸酶與待篩選分子先行共同孵育足夠長的時間，然后再加入修飾了自聚集熒光基團(tuán)的底物，抑制能力強(qiáng)的分子能夠顯著降低磷酸酶的水解活性，無抑制能力的分子則不會對原磷酸酶活性造成影響，因此，我們可以通過水解反應(yīng)之后產(chǎn)物分子的聚集產(chǎn)生的熒光信號的強(qiáng)弱來判斷抑制劑的作用效果。
[0026]在第三方面，本發(fā)明提供所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子在監(jiān)測水解酶活性中的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明中，所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子結(jié)合熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平。
[0028]作為優(yōu)選方案，本發(fā)明通過活細(xì)胞成像實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空監(jiān)測。
[0029]作為優(yōu)選方案，本發(fā)明在活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中進(jìn)行藥物篩選。
[0030]本發(fā)明的有益效果為:
[0031]本發(fā)明通過將水解酶的作用底物分子與聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子連接生成酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子，其在水解酶的作用下水解后，生成的產(chǎn)物分子水溶性降低，在自聚集發(fā)光熒光基團(tuán)的作用下組裝成一定的納米結(jié)構(gòu)，并可以被激發(fā)出一定波長的熒光以用來成像，因此便將酶促反應(yīng)與熒光的有無和強(qiáng)弱聯(lián)系起來，結(jié)合熒光顯微技術(shù)，可以很方便的對活細(xì)胞內(nèi)這種生化酶促反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控。因此，本發(fā)明避免了傳統(tǒng)發(fā)光分子的聚集誘導(dǎo)發(fā)光淬滅和光淬滅現(xiàn)象，適合水解酶活性水平的長時間時空監(jiān)測；而且其生物相容性強(qiáng)，可以自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空監(jiān)測，可應(yīng)用于藥物篩選領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1顯示酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子四苯基乙烯-三酪氨酸磷酸(TPE-YpYY)應(yīng)用于大鼠原代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性標(biāo)記和時空監(jiān)測示意圖，其中a顯示TPE-YpYY及其去磷酸化形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，b顯示TPE-YpYY去磷酸化后發(fā)生聚集誘導(dǎo)發(fā)光。
[0033]圖2顯示TPE-YpYY離子阱質(zhì)譜(a )、TPE-YYY離子阱質(zhì)譜(b ) ; TPE-YpYY高效液相色譜(d)、TPE-YYY高效液相色譜(e);和TPE-YpYY在體外經(jīng)堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase, ALP)處理前后的高效液相色譜(f)、熒光光譜以及熒光光學(xué)照片(C)。
[0034]圖3顯示TPE-YpYY的噻唑藍(lán)法測定大鼠原代成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力測試結(jié)果圖(A);經(jīng)釩酸納處理前后堿性磷酸酶對TPE-YpYY作用前后的熒光光譜(B);說明合成TPE-YpYY具有良好的生物相容性，并能根據(jù)熒光的強(qiáng)度說明抑制劑對磷酸酶的抑制作用。
[0035]圖4顯示釩酸鈉原位抑制實(shí)驗的共聚焦顯微照片，包括:經(jīng)20 μ M/mLTPE-YpYY處理I小時后的大鼠成骨細(xì)胞(T);未經(jīng)任何處理的對比組(C);經(jīng)20 μ M/mL TPE-YpYY處理I小時后，換培養(yǎng)基為100 μ M釩酸鈉作用半小時后的成骨細(xì)胞(T-V) ;100μΜ的釩酸鈉處理半小時后，再20μΜ/ιΛ TPE-YpYY作用I小時后的成骨細(xì)胞(V-T) ;BF表示普通明場照片，F(xiàn)L表不突光場照片?！揪唧w實(shí)施方式】
[0036]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。本發(fā)明中所使用的激光共聚焦顯微鏡(NikonTi Eclipse,日本)為普通型號，附帶可以保持恒溫恒濕的載物臺，非常適合進(jìn)行活細(xì)胞的觀察，本儀器具有高普適性，易于操作。
[0037]實(shí)施例1
[0038]首先，本實(shí)施例描述自聚集發(fā)光分子四苯基乙烯羧酸衍生物的合成，路線如下:
【權(quán)利要求】
1.一種酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子，其特征在于，其由水解酶的作用底物分子連接聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子構(gòu)成； 優(yōu)選地，所述水解酶選自磷酸酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶或泛素羧基末端水解酶，優(yōu)選磷酸酶，更優(yōu)選堿性磷酸酶； 優(yōu)選地，所述底物分子選自多肽、蛋白、寡糖或核苷酸，優(yōu)選多肽，更優(yōu)選YpYY肽序列，其中Y代表酪氨酸、P代表磷酸基團(tuán)； 優(yōu)選地，所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子選自四苯基乙烯及其衍生物或噻咯類，優(yōu)選四苯基乙烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子，其特征在于，所述酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子是由水解酶的作用底物分子與聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子通過酰胺反應(yīng)或點(diǎn)擊反應(yīng)生成的。
3.—種監(jiān)測酶活性水平的方法，其特征在于，所述方法為:將權(quán)利要求1或2所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子摻入活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中，通過突光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的監(jiān)測酶活性水平的方法，其特征在于，將所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子摻入活細(xì)胞中，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空分布，即細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平隨時間的變化和水解酶在細(xì)胞內(nèi)的空間分布。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的監(jiān)測酶活性水平的方法，其特征在于，在摻入所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子之前或者之后，向活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中摻入相應(yīng)水解酶的抑制劑，通過熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映抑制劑對相應(yīng)水解酶的活性抑制。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的監(jiān)測酶活性水平的方法，其特征在于，所述抑制劑是針對相應(yīng)水解酶的藥物分子。
7.如權(quán)利要求1或2所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子在監(jiān)測水解酶活性中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的酶響應(yīng)性自聚集發(fā)光分子結(jié)合熒光顯微技術(shù)對熒光信號的監(jiān)測來反映水解酶活性水平。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，通過活細(xì)胞成像實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶活性水平的時空監(jiān)測。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，在活細(xì)胞或者含有相應(yīng)水解酶的細(xì)胞外反應(yīng)體系中進(jìn)行藥物篩選。
【文檔編號】G01N21/76GK103529017SQ201310468479
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】梁興杰, 張旭, 鄒國漳, 趙元元 申請人:國家納米科學(xué)中心