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一種多糖及其組份定量方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及糖類測定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種多糖及其組份定量方法，多糖樣品溶液經(jīng)高效液相凝膠排阻色譜(HPSEC)或不對(duì)稱場流分離，聯(lián)用激光光散射(LLS)、示差折光(RI)和紫外檢測(UV)技術(shù)分析，以比折光指數(shù)增量值(dn/dc)為0.146mL/g(0.130-0.160mL/g)或先經(jīng)示差折光檢測技術(shù)測得的多糖或其組份dn/dc值，計(jì)算選定分子量分布范圍的多糖或其組份含量。本發(fā)明可用于植物、真菌等多糖及其產(chǎn)品的含量測定，為多糖類物質(zhì)的質(zhì)量控制提供準(zhǔn)確、高效、簡便方法。
【專利說明】一種多糖及其組份定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及糖類測定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種多糖及其組份定量方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多糖是由單糖分子縮合而成的一類高分散、多聚的碳水化合物。作為生命有機(jī)體必不可少的成分，它與維持生命的能量代謝及多種生理機(jī)能有著密切聯(lián)系?，F(xiàn)代藥理研究證明糖類物質(zhì)具有廣泛的生物活性和藥理作用，已與蛋白質(zhì)、核酸、脂類并稱為生命四大基礎(chǔ)物質(zhì)。近年來,真菌類、植物類、海洋產(chǎn)物等來源的多糖因其顯著及特異的生物活性如抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及血脂、抗氧化以及抗炎抗病毒等引起了人們的廣泛關(guān)注。目前市面上已有大量的不同種類的多糖類醫(yī)藥保健品在銷售。然而，多糖及其產(chǎn)品定量分析一直缺乏特異準(zhǔn)確的方法，已成為多糖及其產(chǎn)品質(zhì)量控制亟待解決的關(guān)鍵問題。
[0003]目前，多糖定量方法常將多糖徹底水解為單糖，再經(jīng)顯色或者色譜方法測定含量，然而這些定量方法常因強(qiáng)酸條件下單糖容易被破壞或具還原性質(zhì)的成分及單糖和寡糖干擾而導(dǎo)致結(jié)果失真。此外，氣相色譜法等需要對(duì)單糖進(jìn)行衍生化處理，操作繁瑣、耗時(shí)，并且這些方法一般只能測定總糖含量，不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多糖及其不同分子量組份的含量測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確測定多糖及其組份含量的方法。本發(fā)明可克服現(xiàn)有技術(shù)準(zhǔn)確性差、操作繁瑣等不足。實(shí)現(xiàn)多糖及其組份特異、準(zhǔn)確、快速定量分析。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟如下:
[0006](I)、制備標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液并測定多糖比折光指數(shù)增量值(dn/dc):采用流動(dòng)相配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液(包括不同系列分子量的右旋糖酐、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖、燕麥葡聚糖等)，經(jīng)微濾膜過濾后，以示差折光檢測待測樣品多糖dn/dc值。
[0007](2)、制備待測樣品多糖溶液并測定多糖比折光指數(shù)增量值:不同植物或真菌樣品(包括冬蟲夏草、蛹蟲草、赤芝、紫芝、松杉靈芝、人參、竹節(jié)參、手掌參、黃芪、香菇、茯苓、猴頭菇、銀耳、木耳、綠茶、烏龍茶、決明子、石斛、枸杞、龍眼等)，采用水提醇沉方法制備多糖，并使用流動(dòng)相配制合適系列濃度(如0.2,0.4,0.6,0.8、1.0、1.2mg/mL)多糖溶液，經(jīng)示差折光檢測器(RI)測定不同待測樣品多糖dn/dc值。在測定植物或真菌多糖時(shí)，dn/dc值可直接選用 0.146mL/g 或 0.130-0.160mL/g 間任一值。
[0008](3)、在線分離及激光光散射(LLS)、示差折光(RI)和紫外(UV)檢測聯(lián)用技術(shù)分析:采用單柱或者多柱高效凝膠排阻色譜模式(HPSEC)或不對(duì)稱場流對(duì)標(biāo)準(zhǔn)多糖或樣品多糖進(jìn)行分離，并聯(lián)用LLS、RI以及UV檢測器，剔除樣品中有明顯UV信號(hào)的主要非多糖物質(zhì)，再利用步驟2測得的多糖dn/dc值，根據(jù)LLS和RI信號(hào)，利用比折光指數(shù)增量與濃度關(guān)聯(lián)方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)計(jì)算多糖或其選定分子量組份含量。[0009]式中α是示差折光檢測器儀器常數(shù)，Vi和Viba-是多糖示差信號(hào)和基線信號(hào)，dn/dc是多糖比折光指數(shù)增量。
[0010](4)、方法準(zhǔn)確性評(píng)價(jià):比較本發(fā)明方法測定標(biāo)準(zhǔn)多糖含量與實(shí)際配制的多糖含量，以平均相對(duì)偏差評(píng)估方法的準(zhǔn)確性。此外，分別以自身標(biāo)準(zhǔn)多糖和葡萄糖作對(duì)照，分別比較本發(fā)明方法與硫酸一苯酚法和HPLC-ELSD法一致性。
[0011](5)、定量方法的簡化:準(zhǔn)確dn/dc值的測定依賴于純的多糖對(duì)照品，實(shí)際工作中難以實(shí)現(xiàn)，這也是目前硫酸-苯酚法常以葡萄糖為對(duì)照品進(jìn)行多糖定量主要原因。因此，選擇一個(gè)合適的dn/dc值，對(duì)樣品多糖進(jìn)行定量估算具有非常重要的意義。本發(fā)明方法測定多種標(biāo)準(zhǔn)多糖以及植物和真菌來源的樣品多糖，以其平均dn/dc值或其范圍內(nèi)其他dn/dc值代替樣品真實(shí)dn/dc值直接估算多糖含量，結(jié)果準(zhǔn)確性高，切實(shí)可行。
[0012]本發(fā)明的一種多糖及其組份定量方法，該方法不會(huì)因?yàn)閺?qiáng)酸條件下單糖容易被破壞或具還原性質(zhì)的成分及單糖和寡糖干擾而導(dǎo)致結(jié)果失真，不僅能測定總糖含量，而且能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多糖及其不同分子量組份的含量測定?？捎糜谥参铩⒄婢榷嗵羌捌洚a(chǎn)品中多糖及其組份含量測定，為多糖類物質(zhì)的質(zhì)量控制提供準(zhǔn)確、高效、簡便方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1-1為右旋糖酐251mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0014]圖1-2為右旋糖酐2701mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0015]圖1-3為右旋糖酐4101mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0016]圖1-4為阿拉伯半乳聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0017]圖1-5為阿拉伯聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0018]圖1-6為葡甘露聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0019]圖1-7為燕麥葡聚糖251mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0020]圖1-8為木葡聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0021]圖2-1為本發(fā)明中人參多糖的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0022]圖2-2為本發(fā)明中三七多糖的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0023]圖2-3為本發(fā)明中竹蓀多糖的HPSEC和絕對(duì)分子量分布圖；
[0024]其中A表示RI信號(hào)圖，B表示分子量分布圖，C表示紫外信號(hào)線。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:
[0026]配制標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液:采用0.9% NaCl溶液分別配制系列濃度(0.2,0.4,0.6,0.8、
1.0、1.2mg/mL)右旋糖酐25、右旋糖酐270、右旋糖酐410、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、葡甘露聚糖、燕麥葡聚糖、木葡聚糖溶液，過0.45 μ m微濾膜后，示差折光檢測器測定各標(biāo)準(zhǔn)多糖dn/dc ;采用0.9% NaCl溶液配制右旋糖酐25、右旋糖酐270、右旋糖酐410、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、葡甘露聚糖、燕麥葡聚糖、木葡聚糖至終濃度分別為lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL,過0.45 μ m微濾膜,用于標(biāo)準(zhǔn)多糖含量測定；
[0027]比折光指數(shù)增量值(dn/dc)測定:利用示差折光檢測器(RI)，測定各標(biāo)準(zhǔn)多糖系列濃度時(shí)RI信號(hào)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)多糖dn/dc值；
[0028]在線分離及多角度激光光散射(MALLS)、示差折光(RI)和紫外(UV)檢測聯(lián)用技術(shù)分析:色譜條件為流動(dòng)相，0.9% NaCl溶液；流速，0.5mL/min ;柱溫，35°C ;進(jìn)樣量，50至100 μ L ;色譜柱，TSK-GELG-4000PffXL(300mmX 7.8mm, 1.d.);檢測器，18 角度激光光散射和示差折光檢測器，以及紫外檢測器(檢測波長λ = 280nm)；
[0029]標(biāo)準(zhǔn)多糖含量計(jì)算:利用標(biāo)準(zhǔn)多糖dn/dc值，通過比折光指數(shù)增量與濃度關(guān)聯(lián)方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)多糖含量，式中α是示差折光檢測器儀器常數(shù)，Vi和Vibaseline是多糖示差信號(hào)和基線信號(hào)，dn/dc是多糖比折光指數(shù)增量；另外，可通過
【權(quán)利要求】
1.一種多糖及其組份定量方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、制備標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液及待測樣品多糖溶液:采用流動(dòng)相配制合適系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液；采用不同提取方法制備待測樣品多糖，并采用流動(dòng)相配制成合適系列濃度的待測樣品多糖溶液； (2)、測定標(biāo)準(zhǔn)多糖及待測樣品多糖比折光指數(shù)增量值:采用示差折光檢測器測定標(biāo)準(zhǔn)多糖和/或待測樣品多糖的比折光指數(shù)增量值； (3)、在線分離與激光光散射、示差折光和紫外檢測聯(lián)用分析:采用高效凝膠排阻色譜或不對(duì)稱場流分離不同分子量多糖，在線分離與激光光散射、示差折光和紫外檢測同時(shí)檢測，得到待測樣品多糖的在線分離與激光光散射、示差折光和紫外信號(hào)； (4)、多糖及其組份定量分析:剔除樣品中有紫外信號(hào)的主要非多糖組份，利用步驟(2)測得dn/dc值，根據(jù)在線分離與激光光散射和示差折光信號(hào)，利用比折光指數(shù)增量與濃度關(guān)聯(lián)方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)計(jì)算選定分子量范圍多糖或其組份含量； 其中，式中α是示差折光檢測器儀器常數(shù)，Vi和Viba-是多糖示差信號(hào)和基線信號(hào)，dn/dc是多糖比折光指數(shù)增量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(I)中所述的流動(dòng)相為水、氯化鈉、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀或二甲基亞砜水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(I)中所述制備待測樣品多糖的不同提取方法為:微波輔助水提取、熱回流水提取、超聲水提取或加壓水提取方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，在測定植物或真菌多糖時(shí)，所述步驟⑵中的dn/dc值，直接選用0.146mL/g或0.130-0.160mL/g間任一值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(3)中所述的凝膠排阻色譜，是指利用不同分子排阻尺寸的凝膠色譜柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，所述凝膠色譜柱為單柱模式。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，所述凝膠色譜柱為多柱模式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(3)中所述的激光光散射為低角度激光光散射。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(3)中所述的激光光散射為90°角激光光散射。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖及其組份定量方法，其特征在于，步驟(3)中所述的激光光散射為多角度激光光散射。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103940940SQ201410172342
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】李紹平, 趙靜, 吳定濤, 張杰良 申請(qǐng)人:李紹平